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多氯联苯(PCBs)是广泛传播的环境污染物,被联合国环境规划署理事会选为持久性有机污染物类(POPs)物质。PCBs具有多种毒性效应,包括内分泌毒性、免疫毒性和神经毒性等。PCBs在体内会通过CYP450酶系统降解成OH-PCBs,继而生成PCB醌类代谢物。PCB醌具有比母体更高的活性和更强的毒性作用,而关于这类PCB醌类物质的毒性效应在很大程度上是未知的。本论文中,我们在细胞和动物水平全面探索了醌型PCB代谢产物(PCB29-pQ)的毒性效应,并深入研究PCB29-pQ暴露下细胞死亡和免疫毒性的作用机制。第一部分:本部分主要研究PCB29-pQ诱导MLKL蛋白磷酸化,驱动Hela细胞的程序性坏死,并深入探索了p-MLKL蛋白在程序性坏死和外泌体分泌之间的相互作用。首先,PI染色和LDH释放实验证实了PCB29-pQ诱导Hela细胞的膜损伤,表明程序性坏死发生。然后,Western blot检测了程序性坏死的关键通路蛋白RIPK1、RIPK3、和MLKL的表达,使用MLKL si RNA抑制MLKL表达后逆转了PCB29-pQ对Hela细胞的毒性。接下来,我们发现PCB29-pQ刺激的p-MLK蛋白表达增强了外泌体的生物发生和分泌。外泌体与p-MLKL相互作用,并包裹p-MLKL蛋白释放到细胞外,最终缓解PCB29-pQ诱导的程序性坏死。最后,我们使用外泌体分泌抑制剂GW4869作用于Hela细胞,发现抑制外泌体显著提高Hela细胞程序性坏死水平。这表明PCB29-pQ在攻击细胞时建立了p-MLKL-外泌体分泌的负反馈回路。总体而言,我们的实验表明外泌体包裹p-MLKL蛋白释放对PCB29-pQ诱导的程序性坏死具有保护作用。第二部分:本部分主要探究PCB29-pQ诱导中性粒细胞NETosis-一种不同于凋亡和坏死的新型死亡方式,也称中性粒细胞胞外陷阱(NETs)。首先,通过扫描电镜和免疫荧光拍照定性分析NETs的释放现象,结果表明PCB29-pQ明显诱导NETs形成。之后,胞外DNA定量分析以及MPO释放实验表明PCB29-pQ在时间梯度和浓度梯度作用下诱导NETs释放。接下来,我们探究NETs形成的机制,使用PAD4抑制剂Cl-amidine,并通过Western blot和免疫荧光实验检测H3Cit的表达以及与胞外DNA的共定位。我们发现Cl-amidine抑制PAD4后,消除了PCB29-pQ作用后H3Cit蛋白表达以及H3Cit与胞外DNA的共定位。这说明PAD4参与PCB29-pQ诱导NETs释放的过程。PAD4激活后,诱导染色质解聚并随着细胞膜破损释放到细胞外形成以DNA为骨架的网络结构是NETs形成的必要过程。CCK8实验和LDH释放以及PI染色证实了PCB29-pQ对中性粒细胞的膜破损程度。此外,我们发现PCB29-pQ暴露中性粒细胞后诱导ROS产生和自噬通路的激活。使用ROS清除剂NAC和自噬抑制剂3-MA探究ROS和自噬对NETs形成的影响,实验发现NAC和3-MA显著逆转NETs的形成。总的来说,我们的研究表明PCB29-pQ诱导PAD4激活并瓜氨酸化组蛋白导致染色质解聚,细胞膜破损后NETs释放并伴随着细胞死亡,这些过程是由细胞内ROS和自噬信号介导的。第三部分:鉴于PCB29-pQ对中性粒细胞的毒性效应提示其免疫毒性,本部分主要在动物水平研究PCB29-pQ连续暴露对小鼠脾脏T细胞和B细胞的影响,直接在小鼠体内评估了PCB29-pQ的免疫毒性作用。我们使用C57BL/6小鼠经PCB29-pQ浓度梯度处理(2.5,5,10 mg/kg体重,每周腹腔注射一次,连续4周)。实验表明,PCB29-pQ暴露后小鼠体重减轻,但脾脏器官指数显著增加,且脾脏结构明显肿大损伤。然后,我们提取暴露完成后的小鼠脾脏单细胞悬液,发现脾脏淋巴细胞亚群包括CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD19+B细胞都明显减少。接着,我们探究脾脏淋巴细胞减少的原因,通过TUNEL染色和组织caspase-3免疫荧光分析表明脾脏细胞凋亡增加。荧光定量PCR分析发现凋亡基因caspase-3和Bax都显著上调而抗凋亡基因Bcl-2却减少。我们还发现PCB29-pQ在脾脏中诱导MDA水平的显著增加,以及SOD酶活性减弱,这证明PCB29-pQ诱导了脾脏氧化应激。最后,我们探究了脾脏中Th1和Th2标志基因的表达,结果表明PCB29-pQ作用后引起Th1/Th2细胞因子失衡,并且促进Th1型免疫反应。总之,我们发现PCB29-pQ处理靶向凋亡途径和Th1/Th2细胞因子不平衡,诱导小鼠脾脏功能障碍显示明显的免疫毒性。总之,我们探究了PCB29-pQ诱导的不同细胞死亡毒性及免疫毒性,以期补充加强PCBs醌类代谢产物的毒性作用机制,为更好的预防和处理PCBs类物质提供新的思路和见解。