食碱戈登氏菌YC-RL2降解邻苯二甲酸酯的分子机制

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邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)的毒性和致癌性受到越来越多的关注。PAEs在不同环境介质中普遍检出,甚至极地偏远地区如北极圈内也有检出。因其半挥发性和疏水性,PAEs能够长距离运输并在环境中存留。PAEs可以在厌氧和营养不良的环境中存留多年。Gordonia属(放线菌门)在PAEs降解中尤其重要。虽然微生物降解PAEs的途径已被阐明,但菌株和酶的基因信息有限且能够水解高分子量PAEs的酶很少被报道。利用Biosciences RS II平台和单分子实时(SMRT)技术对分离的食碱戈登氏菌YC-RL2基因组进行测序。利用NCBI原核生物基因组注释程序进行注释。生成的基因组序列为4979656 bp,平均G+C含量为67.45%。平均核苷酸一致性证实菌株YC-RL2确实是G.alkanivorans。在COG数据库中进行检索;3132个CDSs聚类到COG家族,预测有1808个CDSs参与了111个通路。95个KEGG注释基因被预测参与了外源物质降解。未发现PAEs降解操纵子,表明菌株YC-RL2具有一种新PAEs降解途径。203个CDSs和22个CDSs分别被标记为酯酶/水解酶和双加氧酶基因。采用antiSMASH(细菌4.0版)共预测了53个生物合成基因簇(BGCs)参与抗生素和次级代谢产物。本研究从G.alkanivorans YC-RL2基因组中克隆了编码羧酸酯酶的基因Car259和编码邻苯二甲酸单-2-乙基己酯(mono-2-ethylhexyl phthalate,MEHP)水解酶的基因MehpH,并用pET32a(+)质粒在大肠杆菌中异源表达。以对硝基苯酯为底物,采用酶标法测定了pH、温度、离子、溶剂和抑制剂等环境因子对Car259的影响。Car259分子量约59 kDa,在pH 8.0和45℃时活性最高,能够水解短链至中链的对硝基苯基酯。该酶对二价金属离子和有机溶剂具有良好耐受性。Car259对高分子量PAEs具有较好的活性,尤其是邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)。高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)检测到两种主要中间体:邻苯二甲酸(phthalic acid,PA)和MEHP。利用Autodock工具进行分子对接,并通过PyMOL展示,结果表明,Ser200-His429-Glu328构成了催化三联体。Car259作为Gordonia属的酯酶,能水解PAEs的两个酯键。采用酶标法研究了环境因子对MehpH活性的影响。该酶的最佳温度和pH值分别为40℃和8.0。该酶在有机溶剂、洗涤剂和离子的存在下能够保持稳定的活性。但是,其活性被2 mM的Ni2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+离子、1 mM的苯基甲基磺酰氟化物、0.5 mM的对氧磷、1 mM的苯乙二醛、2 mM的焦碳酸二乙酯和5 mM的毒扁豆碱抑制。MehpH中存在丝氨酸水解酶的保守序列GXSXG和催化三联体DSH。氨基酸残基Thr152和Ser230具有较高的保守性,与MEHP密切相关(距离为5.8(?)和3.6(?)),可能在催化中发挥重要作用。但MEHP与Ser125、His291、Asp259的关系并不十分密切。上述研究结果表明,戈登氏菌属具有巨大的未开发生物技术潜力,可进一步开发利用。结果还表明,该菌株YC-RL2在外源生物特别是PAEs的生物修复方面具有广阔的应用前景。
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