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研究背景肺癌已经成为我国发病率及死亡率位居首位的恶性肿瘤,其中80%的肺癌是非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)。尽管近年来手术、放疗及化疗治疗手段取得了新的进展,然而肺癌的5年生存率仍然低于15%;因此积极寻找肺癌早期诊断指标和新的治疗靶点尤其重要。随着高通量测序技术的飞速发展,大量的长非编码 RNAs(longnon-coding RNAs,1ncRNAs)被挖掘。LncRNAs是一类转录本长度超过200nt的RNA分子,其缺少有效开放阅读框,不编码蛋白质或仅编码一些短肽。研究显示1ncRNAs可在多个层面的调节基因的表达,参与各类疾病的进程。LncRNAs在肿瘤发展中发挥重要作用,其在肺癌中的研究价值也逐渐被挖掘。长非编码RNA00312(1inc00312)又名NAG7,是长2903nt的、位于3号染色体的基因间的长非编码RNA。Linc00312最先在鼻咽癌中发现,其阳性表达与鼻咽癌的肿瘤大小成负相关,与其淋巴结转移成正相关。Linc00312可通过抑制miR-197-3p抑制膀胱癌细胞的侵袭和转移。通过对肺癌微阵列数据集GSE19188和GSE18842中的1ncRNAs表达谱分析发现,1inc00312是在肺癌中下调最为明显的1ncRNA,提示其在肺癌的发生发展中可能扮演着重要的角色。然而1inc00312在肺癌中的具体作用和相关分子机制并未有深入的研究。本研究将首先通过对临床组织标本及血液标本分析1inc00312表达水平与NSCLC之间的相关性;进一步通过体内外实验观察1inc00312异常表达对NSCLC增殖、侵袭和转移的影响,并探索其中可能的分子机制,为NSCLC的发病机制及寻找新的治疗靶点提供理论依据。研究方法1.定量PCR检测1inc00312在配对NSCLC组织中的表达并分析其表达水平与患者临床特征的相关性。定量PCR检测健康志愿者、肺部其他疾病患者和肺癌患者的血液标本1inc00312的表达水平,利用受试者工作曲线(ROC)分析其诊断效能。2.在NSCLC中干扰或过表达1inc00312,探究其生物学功能。MTT、克隆形成、EDU、流式细胞技术和皮下成瘤实验检测1inc00312对NSCLC细胞增殖和凋亡的影响;Transwell实验检测1inc00312对NSCLC细胞侵袭和转移能力的影响。3.利用相关的 siRNAs(HDAC1/3、EZH2、SUZ12)、抑制剂(HDACs)或过表达质粒(HOXA5)处理NSCLC细胞后利用定量PCR检测HDACs、EZH2、SUZ12和HOXA5对1inc00312表达的调控作用。ChIP-qPCR方法检测HOXA5是否可在1inc00312启动子区富集。挽救实验验证1inc00312是否可介导HOXA5调控的NSCLC增殖、侵袭和转移。4.Western blot检测linc00312调控的下游靶蛋白。定量PCR检测NSCLC组织和细胞中检测linc00312对miR-197-3p的调控作用。利用MTT、transwell实验验证miR-197-3p对NSCLC的增殖和侵袭转移的影响。挽救实验验证miR-197-3p是否可介导linc00312调控的NSCLC增殖和侵袭和转移功能。研究结果1.对100例配对肺癌组织分析发现,相对于配对正常肺组织linc00312在肺癌组织中表达下调了 4.56倍;linc00312在肿瘤直径大于3cm的癌组织和晚期肺癌组织中的表达水平明显较低(P<0.05)。相对于健康志愿和肺部其他其他疾病患者血浆中linc00312的表达水平,其在NSCLC患者血浆中表达水平降低;ROC分析显示区分健康志愿者与NSCLC患者血浆的节点值是8.418(ΔCI),曲线下面积为 0.6743(95%confidence interval:0.5648 to 0.7838,P=0.0042)。2.在PC9、SPC-A1细胞中上调linc00312后能明显抑制细胞的增殖、侵袭和转移能力,并促进细胞的凋亡。在A549中下调linc00312表达后可明显促进细胞的增殖、侵袭和转移能力,并抑制细胞的凋亡。裸鼠皮下瘤实验表明linc00312表达增高组的皮下瘤结节体积较对照组小,肿瘤重量也较轻,Ki-67染色阳性率低而Tunel染色阳性率高。3.外源性抑制HDAC1/3及利用HDACs广谱抑制剂处理PC9细胞,linc00312的表达无明显变化。外源性抑制PC9细胞EZH2和SUZ12的表达,linc00312的表达无明显升高。无论肺癌组织中还是正常肺组织中linc00312与HOXA5的表达成正相关;PC9和SPC-A1中转染HOXA5的过表达质粒后可明显上调linc00312的表达,ChIP-qPCR检测发现HOXA5可在linc00312的启动子区富集;挽救实验发现沉默linc00312的表达能部分挽救单独转染HOXA5的过表达质粒对NSCLC细胞增殖、侵袭和转移能力的抑制作用。4.Linc00312 可明显上调 p53、p21、BAX、E-cadherin 的表达,下调 N-cadherin和MMP9的表达。无论肺癌组织中还是正常肺组织中linc00312与miR-197-3p的表达成负相关,SPC-A1中上调linc00312可明显抑制miR-197-3p的表达,A549中沉默linc00312的表达可明显促进miR-197-3p的表达。miR-197-3p在NSCLC癌组织中上调,沉默miR-197-3p的表达可明显抑制NSCLC的增殖、侵袭和转移。挽救实验发现抑制miR-197-3p的表达能部分挽救单独沉默linc00312对NSCLC细胞增殖、侵袭和转移能力的促进作用。结论与意义1.本研究进一步验证了 linc00312在肺癌组织中表达较低,其在NSCLC患者血浆中的表达水平相较于健康志愿者明显较低,区分健康志愿者和NSCLC患者良好的敏感性,提示linc00312可能为潜在的NSCLC诊断分子标志物。2.首次在NSCLC中证实linc00312可明显抑制其细胞的增殖、侵袭和转移,促进其细胞凋亡,揭示了 linc00312在NSCLC中发挥抑癌基因的功能。3.本研究首次发现HOXA5-linc00312-miR-197-3p通路调控NSCLC的增殖、侵袭和迁移。同时进一步验证在NSCLC中linc00312通过影响p53、p21与BAX的表达调控细胞的增殖凋亡,通过EMT途径调控其侵袭和转移。这为阐明NSCLC分子机制提供了新的理论基础。