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目的抗肾小球基底膜(GBM)肾炎是由抗GBM抗体介导的肾小球毛细血管广泛损害的自身免疫性疾病,大多数表现为Ⅰ型新月体肾炎,起病急骤,肾功能急剧恶化,预后差。研究表明,异常的Thl和Thl7型免疫应答是诱发抗GBM肾炎的关键因素。T细胞免疫球蛋白及粘蛋白3(Tim-3)主要分布于效应性Thl、Th17细胞,当其被激活后能传递抑制性信号,导致细胞凋亡,从而引起一系列免疫应答反应。目前已证实Tim-3的配体即为半乳糖凝集素9(Galectin-9, Gal-9),Gal-9与Tim-3结合后,能通过Ca2+-钙蛋白酶-半胱天冬酶(caspase)-1途径诱导活化的CD4+T细胞凋亡。因此,本研究通过建立小鼠抗GBM肾炎模型探讨CD4+T细胞免疫应答在其中发挥的作用,同时利用重组Gal-9蛋白对小鼠抗GBM肾炎进行早期干预,探讨Gal-9是否通过抑制Thl和Th17型免疫反应并改变免疫平衡从而减轻小鼠抗GBM肾炎,并进一步探讨可能的作用机制。方法1.利用C57BL/6小鼠建立抗GBM肾炎,分别于第7、14、21、28天进行以下处理：收集并检测小鼠血清中血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的含量和随机尿中尿蛋白/尿肌酐的水平；留取肾标本观察病理学改变；流式细胞术检测外周淋巴器官和肾脏局部免疫细胞分布情况；ELISA检测血清中IFN-γ、IL-4、 IL-17A、IL-12、IL-10和TGF-β1等细胞因子的表达水平；Real-time PCR检测肾组织中IFN-γ、IL-4、IL-17A. TGF-β1、CCL-2、CCL-4和CCL-5等指标的基因水平。2.利用Gal-9对小鼠抗GBM肾炎进行早期干预,观察肾组织病理改变及肾功能水平,检测外周淋巴器官和肾脏局部免疫细胞浸润情况以及相关细胞因子的表达水平。3.获取C57BL/6小鼠淋巴细胞,利用MACS分选CD4+naive T细胞,增殖活化并分别向Thl/Th2/Th17进行定向分化,培养5d。活化的CD4+T细胞及亚群细胞各分为3组：正常对照组、Gal-9组和Gal-9+α-乳糖组。利用流式检测活化CD4+T细胞的凋亡情况和各组亚群细胞的比例；分别检测活化CD4+T细胞上清中细胞因子的表达水平和细胞中转录因子的蛋白表达；real time-PCR检测Tim-3及T-bet, GATA-3、RORyt和Foxp3等转录因子的基因水平。结果1.与正常对照组小鼠相比,肾炎组小鼠的Scr和BUN于第21天时即明显升高,第28天时肾炎组小鼠Scr (2.68±0.98)、BUN (34.15±2.61)和尿蛋白/尿肌酐(15.85±3.20)均明显高于正常对照组；镜下显示肾炎组小鼠肾脏内新月体形成、GBM不规则增厚和断裂、系膜细胞和基质增生、大量蛋白管型形成和炎症细胞浸润等病变；免疫荧光示兔IgG和鼠IgG沿GBM呈线性沉积。对免疫细胞分布情况进行分析发现,肾炎组小鼠脾脏中CD4+CD69+T细胞、Th1和Th17细胞比例明显增加,同时肾脏局部亦有大量Th1和Th17细胞浸润；血清及肾脏局部IFN-γ、IL-4、IL-17A和TGF-β1等细胞因子表达水平亦相应上调。2.Gal-9干预后小鼠肾组织中较少新月体和蛋白管型形成,系膜细胞和基质增生以及炎症细胞浸润程度较轻,病理进程进展缓慢；免疫荧光显示干预后鼠IgG的沉积明显减少；Gal-9干预后能减轻并延缓小鼠肾功能的恶化；流式检测显示干预组小鼠脾脏组织中CD4+Tim-3+T细胞、Th1和Th17细胞比例下降,肾组织中Th1和Th17细胞浸润亦明显减少,而脾脏和肾脏组织中Th2细胞的表达均上调；干预组小鼠血清和肾脏局部中IFN-y和IL-17A等细胞因子的表达水平均下降；同时,Gal-9干预后肾组织中CCL2、CCL5、CXCL-9、CXCR-3、CXCL-10和CCL20等趋化因子的表达亦减少。3.与正常对照组和Gal-9+α乳糖组相比,Gal-9干预后活化CD4+T细胞凋亡增加,Th1和Thl7比例下降,上清中IFN-y和IL-17A的表达水平亦同时减少,相关转录因子T-bet和RORyt表达下调,与此同时,Tim-3的基因水平下降；各组定向分化细胞中,Gal-9干预后Th1和Th17细胞减少,Th2无明显变化,Treg表达增加；T-bet和RORyt的基因表达水平均下降,GATA-3无明显变化,Foxp3的基因水平则升高。结论CD4+T细胞免疫应答能介导小鼠抗GBM肾炎并在其病理进程中发挥重要的促进作用,而Gal-9则能通过抑制Thl和Th17型免疫反应减轻并延缓小鼠抗GBM肾炎的病理进程,其作用机制部分依赖于Tim-3的结合。