【摘 要】
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肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）作为骨骼肌的负调控因子,对肌肉生长起着抑制作用。了解调控骨骼肌发育和肌纤维表型特征的分子机制对培育高品质商品动物具有重要意义。本试验以C2C12为研究对象,构建MSTN基因敲除的C2C12单克隆细胞系,检测MSTN基因敲除后对C2C12细胞增殖以及糖代谢相关蛋白的影响。为揭示MSTN调控成肌细胞分化和肌纤维类型的分子机制提供研究基础。构建敲除MSTN基
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肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）作为骨骼肌的负调控因子,对肌肉生长起着抑制作用。了解调控骨骼肌发育和肌纤维表型特征的分子机制对培育高品质商品动物具有重要意义。本试验以C2C12为研究对象,构建MSTN基因敲除的C2C12单克隆细胞系,检测MSTN基因敲除后对C2C12细胞增殖以及糖代谢相关蛋白的影响。为揭示MSTN调控成肌细胞分化和肌纤维类型的分子机制提供研究基础。构建敲除MSTN基因的C2C12单克隆细胞系:设计合成sg RNA-MSTN,与BasⅠ酶切后的p X601载体连接并转化,挑取单菌落进行测序鉴定,获得正确的表达载体p X601-Sa Cas9-sg RNA-MSTN。从p LKO.1载体上扩增嘌呤霉素抗性基因,插入p X601表达载体中,获得具有嘌呤抗性的真核表达质粒。将该质粒转染到C2C12细胞中,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,并通过有限稀释方法培养单克隆细胞系,通过Western blot及测序鉴定出MSTN基因敲除的C2C12单克隆细胞系,并命名为MSTN-KO。敲除MSTN基因促进C1C12细胞增殖:使用CCK试剂盒及流式细胞仪检测细胞增殖活力与细胞周期,结果显示,MSTN-KO细胞的增殖活力显著提高,G1期细胞显著减少,G2、S期细胞显著增多;通过RT-q PCR和Western blot分析发现,MSTN-KO细胞的Myo G、Myo D及CDK2等细胞生长因子的表达量显著升高,P21、Smad2等因子的表达量显著降低。提示敲除MSTN基因能够提高C2C12细胞增殖能力。敲除MSTN基因能够通过AKT/m TOR信号通路上调PFKFB3增强细胞糖酵解:通过RT-q PCR分析三羧酸循环限速酶CS、IDH、OGDC与糖酵解关键酶HK、PK、PFK1和PFKFB3的表达量发现,MSTN-KO细胞三羧酸循环限速酶的表达量均降低,糖酵解关键酶表达量均升高;利用PFKFB3抑制剂3PO处理MSTN-KO细胞发现,PFK1、PFKFB3蛋白表达量均降低;此外,MSTN-KO细胞葡萄糖摄取量、乳酸含量、糖酵解通量和Fru-2,6-P2含量均升高;用AKT和m TOR抑制剂处理MSTN-KO细胞,发现PFKFB3蛋白表达量降低。因此推测敲除MSTN能够通过AKT/m TOR通路上调PFKFB3增强细胞糖酵解。
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