研究背景:心肌梗死(Myocardial infarction,MI)是当今发病率和死亡率最高的心血管病之一,严重影响人类健康并加重社会经济负担。据统计,我国60岁以上人群心肌梗死患病率高达27%。心肌梗死是由粥样硬化斑块、血栓以及栓塞等引起的冠状动脉堵塞所造成心肌缺血缺氧,导致大量心肌细胞死亡,但由于成年心肌无法通过自我增殖进行修复,因此大部分心梗病人心功能不断恶化,最终发展为心力衰竭。流行病学调查研究显示,全世界范围内约2600万人患有心力衰竭,且死亡率极高,与恶行肿瘤病人相似。当前针对心肌梗死的治疗只能延缓疾病进程,但都不能有效修复受损心肌,无法有效防止终末事件的发生。经典病理学认为哺乳心脏是终末分化器官,不具备再生能力。随着近年来研究手段的进步,心肌可再生已得到证实,但再生效率低下仍是亟待解决的问题。具有代表性的一项关于人类心脏的研究显示心肌细胞以每年约0.3%至1%的速率进行更新,提示内源性心肌再生的存在,但这种低效的细胞更新通常不足以产生在心脏损伤后具有临床意义的心肌再生。因此,探明内源性心肌再生的机制,并对其进行调控刺激是当前的研究热点。哺乳动物在出生早期仍具有较强心肌增殖能力,但该修复能力在出生后第7天急剧下降。与此同时,心肌代谢方式也在出生后第7天由糖酵解作为主要代谢方式转化为以脂肪酸氧化为主,该心肌代谢方式重编程时间点与心肌增殖能力关闭窗口同步,显示心肌能量代谢方式转变可能是影响心肌增殖能力的关键因素。新近研究以心肌糖脂代谢为切入点,发现抑制脂肪酸代谢可促进糖酵解以及心肌细胞增殖,提示代谢方式对心肌增殖起着重要的调控作用,但代谢方式改变是怎么影响心肌增殖的机制尚不清楚。因此,我们重点关注了糖脂代谢转换所引起的代谢产物频谱改变上。新近非靶向代谢组学分析发现出生后1天与7天小鼠心脏代谢产物谱存在明显差异,在对这些差异代谢产物的筛选过程中,α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)由于变化大、含量高引起我们的重视,并且,既往的研究中显示了α-KG具有促增殖作用,如:外源给予α-KG可显著促进胚胎干细胞增殖。此外,也有报道显示应用α-KG干预可改善压力负荷所造成的心功能不全的预后,但α-酮戊二酸是否影响心肌细胞增殖能力尚无报道。因此,本研究旨在探明α-KG是否作为干预能量代谢促成年心肌细胞增殖的主要介质,明确α-KG是否能够促进梗死后心肌修复、再生,并阐明其下游作用机制。研究方法:第一部分:1.为了探索α-KG在心肌细胞增殖中的作用,我们首先利用不同终浓度的α-KG(0.1m M,1m M,5m M)处理心肌细胞,24小时后利用增殖标记物Ki67免疫荧光染色检测心肌细胞的增殖。2.在细胞中,α-酮戊二酸脱氢酶(Oxoglutarate Dehydrogenase,OGDH)催化α-KG生成琥珀酰辅酶(Succinyl-Co A)和二氧化碳(CO2)。为进一步探索内源性α-KG对心肌细胞增殖能力的影响,我们用si RNA干扰心肌细胞中的OGDH,阻断α-KG的去路,增加其在心肌细胞中的含量。然后利用免疫荧光染色检测增殖标记物Ki67和PH3阳性率。3.为明确α-KG在心脏发育过程中对心肌细胞增殖的影响,我们连续两周对7天龄普通C57/BL6J小鼠进行α-KG腹腔注射(30mg/kg)。两周后,检测小鼠的心脏体重比,比较心脏的大小;取心脏进行切片,利用小麦胚芽凝集素(Wheat germ agglutinin,WGA)染色比较心肌细胞的大小,排除心肌肥大引起心脏体重比增加的可能。使用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,Ed U)脉冲追踪检测心肌细胞的增殖。第二部分:1.α-KG为组蛋白去甲基化酶十文字结构域包含蛋白(Jumonji domain containing protein 3,JMJD3)的辅酶,可激活JMJD3的活性,进而特异地调控H3组蛋白第27位赖氨酸(H3K27)三甲基化水平(H3K27me3)。H3K27me3是基因转录抑制的标志,其去甲基化后可激活基因转录,JMJD3去甲基化酶则能够特异性地去除基因启动子区H3K27me3甲基化状态,进而解除抑制效应。为探明α-KG在心肌细胞中是否也能调控JMJD3的活性,我们用α-KG处理心肌细胞后,比较JMJD3下游靶修饰H3K27me3的表达量。为进一步明确JMJD3是否作为α-KG调控心肌增殖的作用靶点,我们用si RNA和竞争性抑制剂琥珀酸(Succinate)分别干扰和抑制心肌细胞中JMJD3,而后利用免疫荧光染色观察增殖标记物PH3阳性的心肌细胞比率。2.为明确JMJD3下游靶修饰H3K27me3与心肌增殖能力间的关系,我们以1天龄,7天龄以及28天龄的C57/BL6J小鼠为目标,该三个时间点代表心肌增殖能力逐渐减弱。横向比较小鼠心脏中H3K27me3的表达量。3.使用α-KG处理心肌细胞后,利用生物学技术染色质共沉淀-q PCR(Chromatin immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction,Ch IP-q PCR)检测H3K27me3对细胞周期调节基因的影响,并用q PCR进行验证。进一步明确α-KG解除H3K27me3对细胞周期调节基因的抑制。第三部分:1.为了进一步探究α-KG是否能够促进成年小鼠心肌细胞增殖的影响以及促使梗死后心肌修复,我们在C57/BL6J小鼠上建立MI模型,并每天腹腔注射α-KG,连续注射两周。两周后,观察小鼠心功能的变化。取小鼠心脏组织,切片,利用Masson三色染色检测梗死后心脏纤维化程度。利用Ed U脉冲标记检测心肌增殖能力。血管内皮细胞标记物CD31免疫荧光染色检测血管新生。研究结果:第一部分:1.以不同终浓度的α-KG(0.1m M,1m M,5m M)处理心肌细胞后,与对照组相比,Ki67阳性心肌细胞比率明显增加,其中以浓度为5m M时最为显著。2.用si RNA干扰心肌细胞中的OGDH以增加内源性α-KG后,Ki67和PH3阳性心肌细胞数量明显高于对照组。3.相较于对照组,α-KG注射组小鼠心脏体积较大,心脏体重比增加,而WGA染色显示心肌细胞体积并未增大。提示α-KG注射可促进在体心肌细胞增殖,而不影响心肌肥大。α-KG注射可提高Ed U阳性心肌细胞比率,进一步说明了α-KG可促进心肌细胞增殖。第二部分:1.为了探索JMJD3是否是α-KG调控心肌增殖的靶点,我们用si RNA敲低了心肌细胞中的JMJD3。敲低JMJD3后,PH3阳性心肌细胞数量较对照组明显减少。而且,敲低JMJD3后,α-KG促心肌细胞增殖的作用被阻断。同样,抑制剂Succinate抑制JMJD3后结果与si RNA干扰后一致。说明JMJD3是调控心肌增殖的关键分子,并且是α-KG促进心肌增殖的靶分子。2.1天龄小鼠心肌增殖能力最强,7天龄大幅下降,28天龄几乎丧失。H3K27me3表达量在1天龄小鼠心肌中最低,在7天龄小鼠心脏中较高,而在28天龄小鼠心脏中最高。提示H3K27me3可能抑制心肌细胞增殖。3.Ch IP-q PCR结果进一步显示H3K27me3可富集在细胞周期调节基因B1(Cell cyclin B1,CCNB1)、细胞周期调节基因D1(Cell cyclin D1,CCND1)、细胞周期基因依赖激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1)以及细胞周期基因依赖激酶4(Cyclin-dependent kinase 4,CDK4)。上述细胞周期基因对于心肌增殖极为重要。α-KG处理可明显降低H3K27me3在细胞周期调节基因启动子上的的富集,从而解除H3K27me3对细胞周期基因转录表达的抑制。第三部分:1.心肌梗死后2周,α-KG注射组小鼠心功能较对照组得到明显改善,Masson染色显示α-KG注射组小鼠心肌梗死瘢痕面积减小,CD31免疫荧光染色结果显示α-KG可促进血管新生,Ed U免疫荧光染色显示α-KG注射可促进心肌细胞增殖。说明α-KG可促进成年心肌细胞增殖并促使梗死后新机修复。结论:α-酮戊二酸是干预能量代谢促成年心肌细胞增殖的主要介质,α-酮戊二酸通过激活JMJD3活性、增强其对H3K27me3的去甲基化作用,从而解除H3K27me3对细胞周期调节基因的抑制,最终促进成年心肌细胞增殖,达到修复心梗、防治心衰发生的目的。