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研究目的1.前期工作中已经通过分析HPV16中癌基因E7的序列信息,并以此为基础构建靶向于不同靶点的锌指核酶质粒,利用体外的报告体系初步筛选出切割效率最好而毒副作用最小的ZFNs对,同时通过对ZFN的切割域和骨架系统进行优化,筛选出切割效率最高的ZFN对,此项工作已经在前期完成。2.建立VLPs假病毒感染细胞的阳性体系。通过应用HPV16的VLPs包装PrwB红光质粒,得到VLP-PrwB的假病毒。产生的假病毒进行收获及纯化,纯化后的产物分别转染各个细胞系,通过红光的观察来验证VLPs-PrwB假病毒的感染效率。包装纯化后的VLPs-PrwB可以作为后期包装的阳性对照。3.将ZFN目的片段取代PrwB的红光序列,构建到PrwB载体上,形成的质粒用VLPs进行包装,包装后的产物进行收获以及纯化,然后纯化产物对不同细胞进行感染,验证ZFNs对HPV16 E7的切割效果。研究方法1.前期实验中已得切割效率最好而毒副作用最小的ZFN对ZFN-L和ZFN-R。2.构建VLPs包装的阳性质粒:用p16L1L21质粒和PrwB质粒共转染包装工具细胞293FT。转染的p16L1L2质粒在293FT中表达出L1和L2蛋白,并且组装成HPV16的衣壳。衣壳组装过程中,将目的质粒PrwB包装进入衣壳中形成VLP-PrwB假病毒。包装好的VLP-PrwB假病毒进行收集及纯化。纯化后的VLP-PrwB假病毒感染293细胞确定感染的有效滴度。确定滴度后的VLP-PrwB假病毒感染SiHa,HeLa,C33-a和293等细胞后,观察其中红光的发光效率的方法确定其感染效率。3.通过对之前验证针对HPV16 E7有效的锌指核酶目的片段进行扩增,连接构建到PrwB的骨架载体上,分别命名为ZFN-L和ZFN-R。4.构建VLPs包装ZFN-L和ZFN-R:用p16L1L2质粒和ZFN-L和ZFN-R质粒共转染包装工具细胞293FT。p16L1L2质粒在293FT中表达出L1和L2蛋白包装ZFN-L和ZFN-R质粒形成VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒。包装好的VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒进行收集及纯化。纯化后的VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒对SiHa,HeLa以及C33-a细胞进行感染。(1)T7E1实验检测经VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒共同感染的细胞系中DNA是否存在有DNA被切割形成双链断裂(doublestrandesbreak,DSB)并导致同源重组(homologousrecombination,HR)以及非同源性末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)。(2)细胞凋亡可以显示VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒共同感染细胞之后,细胞的凋亡情况。(3)克隆形成实验可以通过VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒感染细胞之后,通过对细胞进行消化以及种植到孔板后,观察细胞克隆的形成个数从而得到假病毒对细胞的增殖能力的影响。(4)western blotting检测VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒感染细胞之后细胞中HPV16的E6,E7蛋白以及和E7相互作用的pRb蛋白的表达。结果1.利用VLPs包装的PrwB质粒形成的VLP-PrwB假病毒,经过收获以及纯化之后,能使得感染的细胞发红光。说明VLPs包装PrwB质粒形成的VLP-PrwB假病毒能够感染细胞,并且其中包装的质粒可以在宿主细胞内进行表达。成功建立VLPs包装质粒形成假病毒的体系,以及作为包装其他质粒形成假病毒的阳性对照。2.VLP-ZFN-L 和 VLP-ZFN-R 假病毒一起感染 SiHa,HeLa 和 C33-a,其中的 ZFN 质粒能够进入细胞内表达出相应蛋白,形成锌指核酶的识别序列以及切割序列,有效的切割DNA靶序列,从而引起:(1)HPV16E7的序列形成DSB,继而激活细胞内DNA的修复机制,从而导致HR以及NHEJ。这种效果在HeLa和C33-a中并没有出现,说明锌指核酶切割的特异性。(2)VLP-ZFNs感染导致SiHa细胞的凋亡增加,但是HeLa和C33-a中并没有出现明显的凋亡。(3)VLP-ZFNs感染细胞之后,SiHa细胞的克隆形成明显减少,但是对HeLa和C33-a的克隆形成的影响并不大。(4)western blotting检测HPV16的E6,E7及相关蛋白时候发现,假病毒感染的SiHa细胞E7蛋白量表达下降,pRb蛋白表达量上升,而HeLa和C33-a的变化不大。讨论1.综上所述,通过对VLP-PrwB假病毒进行包装,证实VLP可以携带目的质粒形成假病毒。这种假病毒可以感染目的细胞,并使目的基因在靶细胞进行表达。证明了 VLP包装形成假病毒的可行性以及该体系的建立,为后期的实验建立了阳性对照。2.通过VLP包装ZFNs形成VLP-ZFNs假病毒,这种假病毒可以感染SiHa细胞,并且其中的ZFNs可以在细胞内表达,ZFNs表达形成的蛋白可以针对特定序列进行切割,本实验中设计的ZFNs针对HPV病毒的E7序列,从而导致HPVE7序列被切割,继而SiHa细胞凋亡。VLP包装锌指核酶,可以提供一种让目的基因进入细胞内的方式,本实验结果,为以后VLP包装形成假病毒,提供了较好的实验基础。