现实环境中人们受到放射线辐射的机会非常多,从食品辐照、医用射线到空间电离辐射,辐射无处不在。大剂量辐射可引起机体多种组织和器官的损伤,甚至诱发细胞突变、癌变、致死等严重后果。辐射产生大量自由基,导致机体氧化应激是辐射损害的主要作用机理之一。吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一种氧化还原酶的辅基,作为电子的供体和受体参与氧化还原过程。大量研究表明PQQ有很强的清除自由基能力。Hari等构建的PQQ基因工程菌有较强的清除自由基能力,上调过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活力,显示出极强的耐辐射能力。本实验室初步研究显示PQQ对高能电子射线照射引起的大鼠皮肤损伤有一定的防护作用。本研究拟从抗氧化损伤角度出发,研究PQQ对60Coγ射线照射细胞的辐射效应的影响;同时建立60Coγ射线照射小鼠损伤模型,进一步探讨PQQ对辐射损伤动物的防护作用。一、PQQ(吡咯喹啉醌)对60Coγ射线照射胃癌细胞株AGS细胞抗氧化能力的影响目的:通过检测PQQ对60Coγ射线照射AGS细胞的生长增殖,细胞抗氧化水平及自由基含量变化,研究PQQ对辐射细胞的防护作用机制。方法:将AGS细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中,置于37℃、5% CO2培养箱,保持饱和湿度,环境温度为25℃。取对数生长期的细胞,经台盼蓝染色,活细胞超过80%者用于实验。实验分四组:正常未照射组、单纯照射组、PQQ处理未照射组、PQQ处理照射组。于照射前4h加入PQQ,PQQ在培养液中的终浓度为10μmol/L。室温条件下,照射组细胞用60Coγ射线照射,照射剂量8Gy,剂量率1Gy/min,单次照射。各组于辐照后6h、24h、48h、72h进行MTT测定,绘制照射后各组细胞的生长曲线;分别于辐照后6h、12h、24h,收集、裂解细胞,制备细胞匀浆,检测细胞T-AOC、SOD及MDA含量。结果:①正常未照射组AGS细胞生长曲线呈倒“Z”状,在24h-48h细胞呈指数增长;其余各组均出现细胞增殖抑制,其抑制程度依次是:单纯照射组﹤PQQ处理未照组﹤PQQ处理照射组。PQQ处理照射组细胞,于24h-48h细胞MTT570nm吸光度一直停留在很低水平,48h之后迅速升高。②照射后6h、12h、24h细胞T-AOC、SOD、MDA含量与正常未照组比较:单纯照射组细胞T-AOC、SOD明显下降,MDA明显升高;PQQ处理照射组细胞SOD、T-AOC明显升高,MDA含量虽比正常未照组高,但显著低于单纯照射组。结论:γ射线照射引起AGS细胞抗氧化水平降低,自由基含量升高,导致细胞的氧化应激。PQQ一方面能直接清除自由基,调节其它抗氧化酶系的活性,保护细胞免受自由基攻击;另一方面通过抑制受照后AGS细胞增殖,有利于遗传物质的损伤修复。同时PQQ也能抑制正常生长的AGS细胞的增殖。二、PQQ(吡咯喹啉醌)对γ射线照射小鼠辐射防护作用的初步研究目的:建立60Coγ射线损伤小鼠模型,经口灌服PQQ,检测小鼠血清抗氧化水平及肝组织损伤程度,初步研究PQQ对γ辐射小鼠的防护作用方法:8周龄的昆明小鼠,雌雄各半。适应性喂养1周后。小鼠随机分未照射组和照射组,其中照射组分低剂量照射组(5Gy)和高剂量照射组(10Gy)。各照射剂量组再分成三组:照射前给药组、照射后给药组、照射未给药组,每组10只。给药组小鼠经口灌服PQQ,口服剂量按体重计2mg/kg/d。照射前给药组小鼠于照射前连续给药7天。至第8天,按分组要求进行60Coγ射线单次照射。照射后给药组小鼠于照射后连续给药7天。于照射后第8天,颈椎脱臼处死小鼠,收集血液及肝,制备血清及肝匀浆,-20℃保存,进行各项指标测定。同时,制作肝切片,HE染色观察其结构。结果:所有10Gy剂量照射组小鼠,于照射后8天全部死亡,照射前口服PQQ组平均存活7天,照射后口服PQQ组平均存活6.2天,单纯照射组平均存活5.3天。5Gy剂量照射未给药组小鼠,血清及肝脏中SOD、T-AOC显著下降,MDA显著升高;肝板排列紊乱,有明显的肝细胞水肿现象。而照射组给药组小鼠,血清SOD、T-AOC含量显著升高,基本达到正常未照组水平,自由基含量虽高于正常未照组,但显著低于单纯照射组;肝脏中SOD含量升高显著。从小鼠肝组织HE染色切片看:所有照射组小鼠肝组织都有肝板排列紊乱,窦周隙缩小或消失,局部出现肝细胞水肿,变性、坏死现象,照射前及照射后给药组肝损伤程度比照射未给药组稍严重。结论:γ辐射引发小鼠全身性的氧化应激,肝脏是重要的辐射敏感器官。本研究显示:PQQ对γ辐射小鼠引起的全身氧化应激有一定的防护作用,PQQ也能在一定程度上延长高剂量辐射小鼠的存活时间。其作用机制:PQQ能直接清除自由基,同时能调动照射小鼠的全身自由基清除系统,尤其是SOD的活性,降低自由基含量。PQQ对肝损伤的没有明显表现出来,主要原因可能是由于辐射引起的肝损伤严重,肝代偿功能下降,PQQ的应用反而加重了肝负担。因此,进一步研究PQQ的处理浓度、处理方式,作用时间将有利于揭开PQQ对急性肝损伤的防护机制。综上所述,PQQ能通过直接清除自由基及调动其它的抗氧化机制,尤其是促进SOD的合成,保护细胞免受自由基攻击,对γ辐照后的细胞和小鼠有一定的抗辐射作用。同时,可促进辐射损伤细胞的凋亡,对肿瘤细胞的增殖也有一定抑制作用。