【摘 要】
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乳腺癌是威胁女性生命健康的重要疾病,乳腺癌细胞的扩散转移是治疗失败的主要原因之一。在癌细胞入侵建立远处的转移性肿瘤过程中,细胞必须通过细胞间连接处,细胞外基质和基底膜的狭窄环境迁移。狭窄环境下的细胞迁移需要细胞的变形。细胞核是最大、最硬的细胞器,因此,它能抵制巨大的形状变化。因此,细胞核变形能力是通过狭窄环境迁移的限制因素。Nesprin-1/2提供了细胞核与细胞骨架之间的机械联系,研究发现它们调
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乳腺癌是威胁女性生命健康的重要疾病,乳腺癌细胞的扩散转移是治疗失败的主要原因之一。在癌细胞入侵建立远处的转移性肿瘤过程中,细胞必须通过细胞间连接处,细胞外基质和基底膜的狭窄环境迁移。狭窄环境下的细胞迁移需要细胞的变形。细胞核是最大、最硬的细胞器,因此,它能抵制巨大的形状变化。因此,细胞核变形能力是通过狭窄环境迁移的限制因素。Nesprin-1/2提供了细胞核与细胞骨架之间的机械联系,研究发现它们调控狭窄环境中细胞核的运动、定位和变形。但是,Nesprin-1/2调控肿瘤细胞核变形的具体机制不清楚。此外,细胞核的转运对细胞迁移有重要影响,对于尾部推力推动细胞核前进和前端拉力拉动细胞核前进的是一直争论的问题。因此本课题主要探讨乳腺癌中Nesprin-1/2通过调控细胞核变形以及力学传递进而影响迁移的分子机制。本课题使用乳腺癌MDA-MB-231细胞进行研究,首先我们构建了Nesprin-1/2敲低质粒,并通过转染、Western Blot技术进行了验证。我们通过使用3μm孔径Transwell小室探究细胞在狭窄环境下的迁移,发现Nesprin-1/2敲低显著减弱细胞迁移能力。使用共聚焦显微镜和原子力显微镜对细胞核的变形能力进行评估,发现Nesprin-1/2敲低使细胞核硬度降低更容易变形。细胞核硬度与核纤层蛋白表达水平相关,为了进一步探究核变形机制,我们使用Western Blot和免疫荧光技术对Lamin A/C的表达水平进行检测,发现Nesprin-1/2敲低导致Lamin A/C水平降低进而使细胞核硬度降低。但是,我们通过q-PCR实验发现,Lamin A/C在mRNA水平没有变化。为了探究Lamin A/C蛋白是否发生了降解,我们使用Caspase-6抑制剂Z-VEID-FMK、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）或广谱蛋白酶体抑制剂MG132处理实验组细胞,发现Nesprin-1/2敲低导致Lamin A/C经蛋白酶体途径发生降解。通过免疫沉淀和Western Blot实验检测Lamin A/C的泛素化水平,发现Nesprin-1/2敲低导致Lamin A/C的泛素化水平增加,进一步证实Lamin A/C蛋白水平的降解。另一方面,我们使用抑制剂处理实验组细胞,发现Nesprin-1/2敲低激活CDK5进而磷酸化Lamin A/C S392位点,使其从核纤层解聚。最后,为了探究Nesprin-1/2传递力到细胞核的机制,我们通过免疫荧光实验观察跨孔迁移过程细胞骨架成分F-actin和p-MLC的分布,发现Nesprin-1/2敲低导致细胞核尾部推力消失,无法推动细胞核前进。综上所述,我们的研究发现Nesprin-1/2通过调控Lamin A/C的表达进而调节细胞核变形以及细胞骨架力的分布共同影响细胞跨孔迁移,我们的结果对未来研究乳腺癌的转移方面提供新思路。
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