松褐天牛的化学感受蛋白基因的扩增及活性分析

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松褐天牛MonochamusalternatusHope是林业中一种重要的害虫,不但取食树木造成危害,而且是松材线虫病的主要传播媒介。以行为调控为基础的生物防治是控制松褐天牛、防治松材线虫病的一种重要手段。昆虫触角是昆虫发挥嗅觉功能的主要器官,触角上着生各种嗅觉感器,是昆虫识别各种环境信号的基本单位。在感器淋巴液中,化学感受蛋白(CSPs)是昆虫触角内特异性结合和运输气味分子的关键媒介,在昆虫识别信息化学物质的过程中起着重要的作用。如果能够明确松褐天牛的化学感受机制,将为更好的生物防治提供理论依据。但松褐天牛化学感受蛋白的具体功能仍不明确。为此,我们以松褐天牛为研究对象,观察研究其触角感器的超微结构,并克隆了一个化学感受蛋白MaltCSP5,分析了MaltCSP5基因的时空表达谱,测定了重组MaltCSP5与13种松树挥发物的荧光结合特性。主要结果如下:  1松褐天牛触角感器的超微结构观察  利用扫描电镜和透射电镜分别观察成熟的雌虫和雄虫的感受器。在雄性成虫的触角上观察到五种结构的感器:锥形感器、毛形感器、指形感器、棒状感器、和瓶状感器,而在雌性成虫的触角上观察到四种感器:锥形感器、毛形感器、瓶状感器、和刺形感器。在雌雄虫触角的顶端可以观察到锥形感器、毛形感器。毛形感器的表面具有较扁的斜面和光滑的挂钩,并存在气孔,推测其具有味觉的功能。锥形感器的表面则没有气孔。刺形感器的纵切面可以观察到树突分支,并且没有气孔分布,这些感器可能是用来感受湿度、温度、压力或二氧化碳。  2松褐天牛MaltCSP5的时空表达和结合特性  通过RT-PCR技术成功克隆了松褐天牛MaltCSP5,开放阅读框为390个碱基对,编码129个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量15KDa,含有4个保守的半胱氨酸。荧光定量PCR(RT-qPCR)的结果显示CSP5基因主要在雄性和雌性的触角中高表达。同时成功构建了重组表达质粒,通过亲和层析获得体外重组纯蛋白。以1-NPN为荧光探针,利用荧光竞争结合实验测定重组的CSP5蛋白在中性和酸性环境下和13种松树挥发物的结合能力。结果显示:在pH7.4的环境中,CSP5和月桂烯、(+)-β-蒎烯和(-)-异长叶烯有很强的结合能力,在pH5.0的环境中该蛋白和挥发物异松油烯、(+)-α-蒎烯、异长叶烯、月桂烯、石竹烯、莰酮和丁羟甲苯具有较强的结合能力。
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