一、研究目的前交叉韧带断裂是常见的运动损伤,断裂后只有进行替代物重建才能恢复关节的稳定和功能。目前临床上常用的韧带替代物主要为自体韧带(肌腱)、异体韧带(肌腱)和人工材料移植物。上述三类重建材料都存在着诸多的弊端,无法成为临床上理想的选择。由于无供区的继发损害,以及保存、取材技术的改进,目前同种异体肌腱在临床上取得了广泛的应用。同种异体肌腱植入体内,愈合过程类似于自体肌腱,需经历组织坏死、血管化、细胞爬行替代、重塑四个阶段。与自体肌腱不同,同种异体肌腱移植后,腱细胞表面的糖蛋白的MHC-1型抗原引起宿主的免疫排斥反应,免疫反应将影响异体肌腱与宿主骨的整合过程,可以导致腱-骨界面愈合延迟和减弱,甚至移植失败。肌腱的细胞外基质(ECM)主要由Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白组成,同种异体及异种个体之间的同一组织,其ECM得成分和结构很相近,其自身的免疫原性低。脱细胞技术可以去除肌腱的免疫成分而保留细胞外成分原有的生物活性及力学特性。重组人骨形态发生蛋白-2具有很强的促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力,已有试验发现可促进自体半腱肌重建ACL的腱骨愈合。本实验使用磷酸三丁酯(TBP)进行脱细胞处理去除同种异体肌腱中的细胞成分,测定其对肌腱的组织学和力学特性的影响,脱细胞后的异体肌腱复合人重组骨形态发生蛋白-2重建兔交叉韧带,定期对重建的ACL进行组织学观察、影像学检测及生物力学的检测,了解脱细胞同种异体肌腱复合rh-BMP-2对ACL重建的影响。二、研究方法(一)同种异体肌腱的脱细胞处理取新西兰兔的趾屈肌腱进行脱细胞处理,使用磷酸三丁酯(TBP)进行脱细胞。TBP法：1、低渗的10mm Tris液(包括丝氨酸蛋白酶抑制剂+金属蛋白酶抑制剂+青霉素/链霉素)保持36h；2、高渗盐水+50mm Tris液(包含1%辛基含苯氧基聚乙氧基乙醇+蛋白酶抑制剂)保持48h；3、Hank’s生理缓冲液进行漂洗；4、1%磷酸三丁酯36h+50mm三羟甲基氨基甲烷48h；5、含有抗生素的硫酸盐缓冲液冲洗+浸泡。(二)脱细胞肌腱的组织学和生物力学测定对脱细胞处理的异体肌腱进行HE染色、DAPI荧光染色检测,观察TBP脱细胞效果。使用二甲基亚甲蓝(DMMB)法测定糖胺聚糖(GAG)含量,检测脱细胞前后肌腱内的GAG含量；使用动物组织基因组DNA小量提取试剂盒测定DNA含量,检测脱细胞前后肌腱的DNA含量变化；使用羟脯氨酸试剂盒测定羟脯氨酸含量,根据羟脯氨酸占胶原蛋白的含量,计算胶原蛋白含量,观察脱细胞前后胶原蛋白的变化；检测肌腱的最大张力负荷和弹性模量,了解脱细胞处理对肌腱生物力学的影响。(三)脱细胞肌腱复合rh-BMP-2重建AGL的影像学观察使用脱细胞肌腱重建兔前交叉韧带,腱骨界面注入含rh-BMP-2的纤维蛋白凝胶,术后1、3、6月分别对患侧膝关节骨隧道段进行CT平扫,在矢状位测量膝关节股骨、胫骨隧道的入口段、出口段及中间段的宽度,并与对照组进行比较,了解脱细胞肌腱复合rh-BMP-2对促进ACL重建后骨隧道段的腱骨愈合的影像学变化。(四)脱细胞肌腱复合rh-BMP-2重建ACL的组织学观察和力学特性检测使用脱细胞肌腱重建兔前交叉韧带,腱骨界面注入含rh-BMP-2的纤维蛋白凝胶,术后1、3、6月分别对患侧膝关节骨隧道段、重建的ACL进行硬组织切片、普通HE染色,观察腱骨界面成骨情况及重建的ACL的炎症反应、细胞增殖等情况,并与对照组进行比较；使用生物材料测试机对术后3、6月的膝关节标本进行ACL抗拔出试验,记录拔出的最大抗拉强度及弹性模量,了解脱细胞肌腱复合rh-BMP-2对ACL重建后腱骨愈合的影响。三、结果(一)脱细胞肌腱的组织学和生物力学测定经磷酸三丁酯(TBP)脱细胞处理的肌腱,HE染色未见细胞成分染色,DAPI荧光染色未见阳性结果,提示细胞成分去除彻底；二甲基亚甲蓝法测定糖胺聚糖含量,发现脱细胞前后对比无明显差异；动物组织基因组DNA小量提取试剂盒测定DNA含量,发现脱细胞前后肌腱内DNA含量明显减少；使用羟脯氨酸试剂盒间接测定胶原蛋白含量,发现脱细胞前后胶原含量无明显差异；生物力学测试发现,脱细胞前后肌腱的最大张力负荷和弹性模量无明显差异。(二)脱细胞肌腱复合rh-BMP-2重建ACL的影像学观察对ACL重建后的兔膝关节行CT平扫,可以较好地重建兔ACL重建模型的影像学情况。术后1月,两组间骨隧道宽度对比无明显差异；术后3月,脱细胞组骨隧道壁不光滑,存在成骨反应,骨隧道宽度与术后1月比较无明显改变,而对照组未见成骨反应,骨隧道宽度与术后1月相比,有增宽趋势,但无统计学差异；术后6月,脱细胞组骨隧道壁成骨反应较前增加,骨隧道宽度与术后1、3月略有增宽,但无统计学差异；而对照组仍无明显成骨反应,骨隧道宽度与术后1、3月相比,出现增宽现象,存在统计学差异。(四)脱细胞肌腱复合rh-BMP-2重建ACL的组织学观察和生物力学测试骨隧道段硬组织切片发现,术后1月,脱细胞组腱骨间隙较小,可见少量Sharpey纤维及软骨细胞生成,而对照组腱骨间隙宽大,无Sharpey纤维及软骨细胞生成；术后3月,脱细胞组腱骨间隙进一步减小,Sharpey纤维及软骨细胞生成增多；而对照组腱骨间隙较前减小,少量Sharpey纤维及软骨细胞生成；术后6月,脱细胞组腱骨间隙几乎消失,Sharpey纤维大量生成排列有序,软骨细胞成熟分化,而对照组腱骨间隙减小但存在,Sharpey纤维及软骨细胞生成较前增多,但无明显成熟分化趋势。重建的ACL,术后1月,脱细胞组可见少量淋巴细胞浸润,而对照组存在大量淋巴细胞浸润；术后3月,脱细胞组胶原纤维排列有序,可见成纤维细胞及软骨细胞增生,而对照组胶原纤维松散,可见少量成纤维细胞,未见软骨细胞；术后6月,脱细胞组软骨细胞大量增生并出现成熟分化,胶原纤维排列紧密、有序,而对照组胶原结构仍较松散,成纤维细胞及软骨细胞数量较少。术后3、6月的生物力学测试,ACL重建的抗拔出试验中,脱细胞组在弹性模量、最大载荷等指标均优于对照组,差异具有统计学意义。四、结论(一)、TBP法能有效去除同种异体肌腱内部的细胞成分,去除免疫原性的同时对肌腱原有的生物学活性及力学特性无明显影响。(二)、CT平扫能较好地重现膝关节重建ACL的影像。脱细胞肌腱复合rh-BMP-2重建兔ACL后,CT平扫发现,与对照组相比,术后3、6月未见骨隧道增宽迹象,腱-骨界面存在成骨反应。(三)、脱细胞肌腱复合rh-BMP-2重建兔ACL后,与对照组相比,术后1、3、6月腱骨界面愈合良好,界面成骨反应逐渐增加,腱骨间隙缩小,异体肌腱细胞爬行替代速度加快。(四)、脱细胞肌腱复合rh-BMP-2重建兔ACL后,与对照组相比,术后3、6月行抗拔出生物力学测试,脱细胞组的弹性模量及最大载荷优于对照组。