背景婴幼儿血管瘤(infantile hemangioma, IH)是多发于婴幼儿的一种良性肿瘤,出生后1个月到1岁内发病率高达8.7%-12.7%[1-3],影响患儿的外貌,部分严重者会涉及功能性器官,甚至危及生命。目前对该病的治疗主要采取手术、药物、激光等措施,或采用联合治疗的方案,但山于缺少对血管瘤病因和病理机制的认识,治疗效果不能令人满意[4]。血管瘤的发病具有以下5个临床特点：①出生后即发病,1个月到1岁内发展迅速；1岁以后病变稳定并开始自发性消退,有着明显的迅速增殖期和自发性消退期的表现。②患者以女性居多,男女比率约为1：3-5[5-6]。③头颈部血管瘤约占全身发病的60%[7]。④白人罹患率是黑种人或黄种人的10-12倍[8]。⑤适当的激素治疗对该病有效[9-10]。研究血管瘤发病机制的首要问题是建立符合IH病变自然进程的动物模型。目前报道过的IH动物模型建立方法主要有5种：①采用鸡冠和肉垂等富含血窦组织制备的皮肤毛细血管瘤模型[11]；②以化学药物如1,2-二甲肼(1,2-dimethylhydrazine dihydrochloride,1,2-DMH)诱发的恶性内皮细胞瘤或血管肉瘤[12]；③通过转基因方法将多瘤病毒(polyomavirus, Py)的中等T抗原(middle T antigen, MT)基因整合到小鼠正常基因序列的恶性多瘤病毒模型[13]；④将体外培养的血管瘤内皮细胞(hemangioma endothelial cell, HemEC)注射入裸鼠(免疫缺陷小鼠)皮下形成血管瘤[14]；⑤裸鼠皮下植入新鲜增殖期血管瘤组织[15]。本课题针对以上模型中报道最多的HemEC皮下注射裸鼠模型和增殖期血管瘤组织块皮下移植裸鼠模型进行了比较,以选择最稳定、可靠的血管瘤动物模型,为接下来血管瘤发病机制的研究打下基础。目的1.探讨体外培养HemEC的可行性。2.比较HemEC注射法和血管瘤组织块植入法裸鼠模型与血管瘤自然进程的相似性以及在血管瘤动物模型建立中的稳定性。方法1.收集山东大学齐鲁医院口腔颌面外科和临沂市肿瘤医院血管瘤科的血管瘤患者组织标本,取样条件为年龄小于3个月并且未接受任何治疗的2例手术切除病例。本研究已告知患儿监护人并签署知情同意书。2.冲洗新鲜婴幼儿血管瘤组织块并修剪成1cm3大小,50%用于HemEC培养,50%用于构建组织块植入法裸鼠皮下血管瘤模型；另取少量组织固定,石蜡包埋后,免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)鉴定葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter1,GLUT1)的表达。3.HemEC体外培养及鉴定：利用组织块贴壁培养法分离并培养HemEC;免疫细胞化学法(immunocytochemistry, ICC)检测内皮细胞标记物第八因子相关抗原因子(factor Ⅷ-related antigen, von Willebrand factor, vWF)和CD34在HemEC上的表达。4.实验用裸鼠(BALB/c nude mice)24只,雌雄不限,鼠龄(28+3.2)d,体重(20.5+2.1)g,购白北京华阜康生物科技股份公司。24只裸鼠随机分为2组：组织块组和细胞注射组,每组分别12只。组织块组：双侧腋窝皮下植入处理过的1cm3大小组织块；细胞组：双侧腋窝皮下注射第3代HemEC。分别记录第7、30、60d两组血管瘤模型移植处瘤体的变化,包括瘤体尺寸、色泽和质地；在各时间点各组随机选取4只裸鼠切取移植处瘤体组织,固定,石蜡包埋后,苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)染色,镜下观察其组织学特点。结果1.IHC法鉴定GLUT1的表达检测血管瘤特异性标记物GLUT1在手术取得组织中的表达为强阳性,证明为增殖期血管瘤组织：HemEC皮下注射法血管瘤裸鼠模型第30d时,瘤体组织GLUT1呈阳性表达。2.HemEC的培养及鉴定HemEC在组织块培养法下生长并传代,细胞贴壁生长,形状不规则,多为多角形或梭形,聚集生长；ICC法检测内皮细胞标记物vWF和CD34,均呈阳性表达。3.HemEC皮下注射法血管瘤裸鼠模型的建立在12只裸鼠双侧腋下部皮下组织注射HemEC后,双侧全部成瘤；第7d时,瘤体约1mm×1mm×1mm大小,镜下见大量HemEC,并逐渐开始形成血管；第30d时,瘤体生长至5mm×4mm×3mm大小,镜下见大量密集生长的HemEC,并有大量HemEC围成的小血管,局部可见大血管；第60d时,瘤体为2mm×3mm×2mm大小,部分HemEC开始逐渐凋亡,血管萎缩或破裂。4.增殖划血管瘤组织块移植法血管瘤裸鼠模型的建立移植组织块到裸鼠双侧腋下部皮下后,1周之内便有1只裸鼠因感染死亡,2只裸鼠因缝线被撕咬或挠抓而过早脱落,导致组织块从体内排出,其余9只裸鼠均双侧腋下成瘤。第7d时,移植块已与机体融合,镜下见HemEC围绕的密集小血管；第30d时,瘤体约2mm×2mm×2mm,镜下见大量移植细胞的变性、坏死,炎细胞遍布,仅有少量血管残留；第60d时,移植组织已完全融于机体,镜下可见移植物已脂肪化,仅见少量血管周围有类似残留移植物存在。结论1.血管瘤组织块贴壁法可以培养出HemEC。2.组织块移植法血管瘤裸鼠模型因高失败率和无法大量建模的缺点,不能为本课题所用。3.皮下注射人血管瘤内皮细胞的血管瘤裸鼠模型建模方法因其稳定性高,特异性强和可重复性的优点,是建立血管瘤的动物模型较为较理想的选择。婴幼儿血管瘤(infantile hemangiomas, IH)是最常见的婴幼儿良性肿瘤之一,尽管对其组织学特点和发病机制的研究众多,但是一直没有将这些问题解释清楚。过去的几十年中,大量科研工作者致力于对该疾病发病机制的研究,也取得了一些进展,并建立了一些相应的学说,如胎盘绒毛膜学说,内皮细胞基因突变,以及外源性因子形成促进细胞生长的微环境等。但是仍然没有一种学说能够完全解释IH所有的临床和生理特征,因此需要一些突破性的发现来帮助我们理解并研究IH的发病机制,从而能够研发出对IH特异性更强的治疗方案。口服普萘洛尔(一种非选择性beta1肾上腺素受体抑制剂)被报道能够有效治疗血管瘤,这一新发现使众多研究者将目光转移到了beta1肾上腺素受体(βadrenergic receptor, β-AR)与血管瘤之间的关系上。血管瘤由以血管瘤内皮细胞(hemangioma endothelial cell, HemEC)为主的多种细胞组成,p2-AR可在内皮细胞表面表达[1],而在HemEC上也发现了有β2和β3-AR的表达[2]。因此我们假设,普萘洛尔发挥治疗血管瘤的作用机制可能是通过以下3个方面实现的：①早期血管收缩。自主神经系统和肾上腺素在皿管管腔收缩与舒张的控制上起着至关重要的作用,肾上腺素依靠激活a1和β2-AR能够控制血管的收缩和舒张,所以单独的p2-AR抑制剂(如普萘洛尔)则可以阻断肾上腺素激活β2-AR引起的血管舒张,并且避免α1-AR被抑制,保留了对血管收缩的刺激。②中期抑制血管生成。在血管瘤增殖发育的旺盛阶段,有两个促血管生成因子的表达异常增高：血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF),在β2-AR抑制剂的阻断作用下,减少的VEGF分泌可有效的抑制血管生成[3]。③长期诱导HemEC的凋亡。HemEC的凋亡被多条信号通路所介导,其中β2-AR被抑制而诱发的下游信号通路所介导的细胞凋亡率最高[4]。验证以上假说的关键是确定β2-AR在血管瘤发病机制中的重要作用,包括β2-AR的表达以及β2-AR表达被干扰后血管瘤症状的改变。以β2-AR为始点,对其下游信号通路的研究将是我们今后工作的重点。目的1.检测p-AR各亚型在血管瘤以及血管瘤内皮细胞中的表达情况。2.观察β-AR各亚型被分别抑制后血管瘤发病情况的改变。3.利用病毒转染携带干扰基因,探讨p2-AR在体内和体外血管瘤发病机制中的作用。方法1.获取新鲜增殖气期血管瘤、静脉畸形(vein malformation, VM)和淋巴管畸形(lymphatic malformation, LM)组织,固定包埋,制作切片,免疫组化法(immunohistochemistry, IHC)检测β1、β2、β3-AR的表达。2.获取新鲜增殖期和消退期血管瘤组织,提取RNA和蛋白,qPCR和WB法检测β1、β2、p3-AR的表达。3.获取新鲜增殖期血管瘤及其周围正常组织,提取RNA和蛋白,qPCR和WB法检测β1、β2、β3-AR的表达。4.组织块法培养HemEC,以脐静脉内皮细胞(HUVEC)为对照,提取RNA和蛋白,qPCR和WB法检测β1、 β2、β3-AR的表达。5.在体外,以梯度浓度普萘洛尔治疗HemEC, MTT法检测细胞增殖能力,成管实验检测细胞成管能力,经对比得到普萘洛尔治疗HemEC的最佳浓度。6.在体外,用最佳浓度的p-AR各亚型特异性抑制剂治疗HemEC, MTT法检测细胞增殖能力,成管实验检测细胞成管能力,得到与普萘洛尔作用最接近的抑制剂所属的p-AR亚型。7.设计并构建特异性干扰p2-AR慢病毒载体,转染HemEC,并提取RNA和蛋白,qPCR和WB法检测β2-AR的表达,以确定其病毒转染率。8.在体外,用普萘洛尔和沉默β2-AR慢病毒(ADRB2-si)处理HemEC,再用高表达β2-AR慢病毒(ADRB2-hi)恢复甚至增加β2-AR的表达,MTT法检测细胞增殖能力,成管实验检测细胞成管能力的变化。9.在HemEC皮下注射血管瘤模型上,用普萘洛尔和ADRB2-si处理HemEC,再用ADRB2-hi恢复甚至增加p2-AR的表达,观察裸鼠模型上瘤体一般情况及组织学变化。结果1.β2-AR在增殖期血管瘤组织中表达阳性,在静脉畸形和淋巴管畸形组织中表达阴性,β1、β3-AR在增殖期血管瘤、静脉畸形和淋巴管畸形组织中均表达阴性。2.β2-AR在增殖期血管瘤组织中表达强于消退期血管瘤组织,β1、β3-AR在增殖期和消退期血管瘤组织中无差异。3.β2-AR在增殖期血管瘤中表达强于其周围正常组织,β1、β3-AR在增殖期血管瘤和其周围正常组织中无差异。4.β2-AR在HemEC中表达强于HUVEC, β1、β3-AR在HemEC和HUVEC中表达无差异。5.10μM浓度普萘洛尔治疗HemEC时,细胞增殖能力和成管能力能够得到最大程度的抑制。6.普萘洛尔和β2-AR特异性抑制剂(ICI)治疗HemEC时,细胞增殖能力和成管能力能够得到最大程度的抑制；β1-AR特异性抑制剂(CGP)能够部分抑制细胞增殖能力和成管能力；β3-AR特异性抑制剂(SR)无抑制细胞增殖和成管的能力。7.成功设计并构建干扰β2-AR的慢病毒载体,ADRB2-si沉默β2-AR表达,ADRB2-hi增加β2-AR表达,Len-em为空白病毒载体对照。8.普萘洛尔和ADRB2-si能够通过降低β2-AR的表达来抑制HemEC的增殖能力和成管能力,ADRB2-hi能够通过增加β2-AR的表达来阻断他们的抑制能力。9.普萘洛尔和ADRB2-si能够通过降低β2-AR的表达来抑制血管瘤模型瘤体生长和瘤体内HemEC的增殖,ADRB2-hi能够通过增加β2-AR的表达来阻断他们的抑制能力。结论β2-AR在血管瘤发病机制中起到了重要的作用,主要表现在以下几个方面：1.β2-AR在增殖期血管瘤组织中表达强阳性,在LM和VM等其他血管性良性病变中无明显表达,β1和β3-AR在以上血管性疾病中均无明显表达；由于血管瘤位真性肿瘤,区别于LM和VM等脉管畸形,因此血管瘤的发病机制可能与β2-AR的表达有一定的关系。2.β2-AR在增殖期血管瘤组织中表达明显高于消退期血管瘤以及瘤体周围正常组织,而β1和β3-AR表达无明显差异；因此p2-AR表达的降低很可能是血管瘤由增殖期转入消退期的原因。3.β2-AR在增殖期HemEC中表达明显高于对照HUVEC,而β1和p3-AR表达无明显差异；血管瘤来源的HemEC能够形成血管瘤,而正常HUVEC无法成瘤,其重要原因很可能为β2-AR表达的不同。4.p2-AR被阻断后,HemEC的增殖和成管能力均受到抑制,而β1和p3-AR被阻断后,HemEC的增殖和成管能力无明显变化；因此β2-AR的表达于HemEC的增殖和成管能力有着密切的联系。5.在体内和体外血管瘤的生长能力都会因为p2-AR的阻断而受到抑制,在重新恢复β2-AR表达后,其生长能力又得到了恢复；因此β2-AR的表达在血管瘤生长过程中起到重要的作用。