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研究背景:甲状腺功能正常的自身免疫性甲状腺炎(AIT)与流产有关,但确切的机制仍不清楚。引起流产的原因有很多,其中母胎界面免疫失衡和妊娠过程中胎盘滋养层细胞入侵子宫内膜障碍是导致流产发生的重要原因。研究表明,程序性细胞死亡-1(PD-1)/程序性细胞死亡-配1(PD-L1)途径对正常妊娠至关重要。PD-1(CD279),属于免疫球蛋白超家族成员,表达较为广泛。PD-L1(B7-H1或CD274)是PD-1的配体之一,在胎盘等一些免疫豁免部位有非常广泛的表达。一方面,PD-1/PD-L1信号通路通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路来维持调节性T细胞和效应T细胞(Treg/Teff)的平衡,从而维护机体的免疫耐受和稳定。另一方面,PD-L1通过MER/ERK信号通路轴赋予细胞侵袭性。目的:研究自身免疫性甲状腺炎是否是因为PD-1/PD-L1含量的降低,一方面对PI3K信号通路的抑制减弱影响母胎免疫平衡,另一方面使ERK的磷酸化水平减弱降低胚胎滋养层细胞侵袭力而导致流产。方法:(1)将CBA/J雌鼠用m Tg免疫诱导成甲功正常Tg Ab阳性的AIT小鼠,然后和Balb/c雄鼠合笼。(2)将小鼠分组(I)对照组;(II)m Tg(+)组;(III)m Tg(+)+PD-L1-Fc(+);(IV)m Tg(+)+PI3K抑制剂(+)。于孕13.5天(GD13.5)处死动物,留取血清、甲状腺和胎盘做后续检查。(3)应用免疫组织化学法(Immuno-Histochemistry)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测胎盘中PD-1,PD-L1,p-PI3K,p-PTEN,p-AKT,p-m TOR,Foxp3,RORγt的蛋白表达。(4)应用免疫组织化学法和Western blot检测胎盘中PD-L1,p-ERK,MMP-2,MMP-9的表达水平。(5)应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,阻断HTR-8/SVneo(HTR8)人绒毛膜滋养层细胞中的PD-L1蛋白的表达。(6)应用免疫组织荧光法和Western blot检测HTR8细胞中PD-L1,p-ERK,MMP-2,MMP-9的表达水平。(7)Transwell法测HTR8细胞侵袭能力。结果:(1)通过ELASA检测观察到每组小鼠外周血中Tg Ab的浓度,m Tg组的血清Tg Ab水平显着高于Con组(P<0.05)和PD-L1-Fc治疗组(P<0.05)。与Con相比m Tg组HE染色显示出甲状腺内有大量的淋巴细胞浸润其中,并且甲状腺滤泡也有明显的扩张和被破坏的迹象,胎盘血管狭窄和血细胞分布减少。但是PD-L1-Fc组中上述现象得到了相应改善。(2)免疫组织化学法和Western blot检测胎盘组织的结果显示,与Con组相比,m Tg组PI3K、Akt、m TOR磷酸化水平以及IL-6和RORγt蛋白表达水平升高;PD-1、PD-L1、TGF-β和Foxp3蛋白表达水平以及PTEN磷酸化水平降低。然而,注射PD-L1-Fc或PI3K抑制剂可以逆转上述变化。与m Tg组相比,PD-L1-Fc组和PI3K抑制剂组中PI3K、Akt、m-TOR的磷酸化水平以及IL-6和RORγt的蛋白质表达水平降低;PD-1、PD-L1、TGF-β和Foxp3蛋白表达水平以及PTEN磷酸化水平增加。(3)免疫组织化学法和Western blot检测胎盘组织的结果显示,与对照组相比,AIT孕鼠胚胎滋养细胞PD-L1,磷酸化ERK、MMP-2和MMP-9的表达含量显着降低。(4)免疫组织荧光法和Western blot检测HTR-8/SVneo(HTR8)人绒毛膜滋养层细胞结果显示,与NC细胞相比,用PD-L1 siRNA干扰的细胞中PD-L1,磷酸化ERK、MMP-2和MMP-9的表达显着降低。(5)Transwell结果显示与NC组细胞相比,用PD-L1 siRNA干扰的HTR-8/SVneo细胞侵袭能力明显降低。结论:(1)自身免疫性甲状腺炎因为PD-1/PD-L1含量的降低,对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路的抑制减弱影响母胎免疫平衡,不过用PD-L1-Fc治疗对自身免疫性甲状腺炎模型具有保护作用,表明PD-L1-Fc的使用可能是治疗自身免疫性甲状腺炎的潜在治疗靶标。(2)自身免疫性甲状腺炎通过减少胎盘滋养层细胞中PD-L1的表达来影响细胞中磷酸化ERK、MMP-2和MMP-9的含量,减弱胚胎滋养层细胞的侵袭力并最终诱导流产。