帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是人类第二大神经退行性疾病,在65岁以上的人群中发病率约为1%。PD的主要病理特征为中脑黑质致密部多巴胺(dopamine, DA)能神经元丢失、纹状体多巴胺含量显著减少以及纤维样嗜酸性包涵体“路易小体”(Lewy body)的蓄积。PD患者典型的临床症状包括静止震颤、肌肉强直、运动迟缓,以及步态不稳等。目前,左旋多巴替代治疗仍然是临床治疗PD的主要药物,但应用左旋多巴的治疗并不能阻断或延缓PD的病理进程。研究表明,当黑质致密部DA神经元损伤达70%-80%时,PD患者才会出现明显的运动症状,即PD一般有5～7年的潜伏期。因此,深入研究PD的病理机制、寻找早期干预PD的治疗靶点或策略是当前PD临床和基础研究的热点和难点。代谢性炎症是指由代谢紊乱如糖尿病、肥胖等所触发的炎症反应,其病理机制涉及经典炎症相关的信号转导通路,包括促炎因子的表达和活性增强。代谢性炎症持续存在于代谢性疾病发病过程中,导致相关组织结构和功能的损伤。2型糖尿病(Type2diabetes, T2D)是一类典型的代谢性疾病,其主要病理特征为胰岛素抵抗以及胰岛β细胞的功能紊乱。同时,T2D患者的胰腺中大多伴随氧化应激损伤和胰岛淀粉样多肽蛋白(islet amyloid polypeptide, IAPP)的沉积。IAPP的高表达可诱导炎症小体(inflammasome)激活、促进IL-1β和IL-18等炎症因子的大量产生,导致T2D病理过程中的炎症反应。近年来,T2D等疾病导致的代谢性炎症与神经退行性疾病相关性的流行病学研究显示,T2D患者发生PD的患病风险显著增加,但具体的机制尚未阐明。因此,本文第一部分工作应用T2D小鼠研究代谢性炎症与PD的相关性。建立慢性MPTP/p PD模型和急性MPTP损伤模型,研究T2D小鼠对神经毒素的易感性及其中脑内的神经损伤。第一部分研究发现,T2D小鼠中脑α-synuclein表达显著上调。α-synuclein是Lewy body的核心成分,α-synuclein高表达可导致中脑黑质DA神经元损伤和缺失,但α-synuclein诱导神经元损伤的具体机制尚未阐明。基于此,本文第二部分工作应用突变型A53Ttg/-α-synuclein过表达小鼠研究α-synuclein过表达对慢性MPTP/p诱导的神经损伤的影响；并应用小鼠源性的小胶质细胞株BV-2细胞,研究并阐明α-synuclein对小胶质细胞介导的炎症反应的影响及其机制。小胶质细胞介导的炎症反应和星形胶质细胞的营养支持功能在脑内发挥着重要的生理病理作用,本文第三部分工作应用原代培养的源自野生型和A53Ttg/tg小鼠中脑的星形胶质细胞,研究α-synuclein过表达对星形胶质细胞营养因子表达及其炎症反应的影响,并观察了α-synuclein过表达对DA受体激动剂促营养因子释放和抗炎作用的影响。第一部分代谢性炎症与帕金森病的相关性研究目的：应用T2D模型小鼠研究代谢性炎症与PD发生的相关性。方法：应用两种T2D模型小鼠ob/ob和db/db小鼠,检测基础状态下WT和T2D小鼠的血糖和血清胰岛素水平。应用HE染色观察小鼠胰腺和肝脏的组织形态和炎症浸润。通过ELISA检测小鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的水平。应用免疫组织化学结合体视学计数分析WT和T2D小鼠中脑黑质致密部SNc和腹侧被盖区VTA DA神经元的数量、星形胶质细胞以及小胶质细胞的数量和活化。通过western blotting检测中脑和胰腺组织α-synuclein、 BDNF、胰岛素通路(AKT-GSK和MAPK p38-ERK通路)、内质网应激相关蛋白(CHOP和GRP78),NF-κB核内p65亚基以及NLRP3炎症小体(NLRP3、 caspase-1和IL-1p)的表达。利用real-time PCR检测中脑炎症因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-a的水平。应用WT和db/db小鼠MPTP皮下注射,继而丙磺舒腹腔注射(MPTP20mg/kg,s.c.,丙磺舒250mg/kg,i.p.,2次／周,连续5周)建立慢性MPTP/p PD模型,模型制备过程中记录小鼠的死亡率,应用免疫组化检测小鼠中脑内的神经病理损伤。应用WT和db/db小鼠腹腔注射MPTP (MPTP20mg/kg,i.p.,4次／天,间隔2h/次),建立小鼠急性MPTP损伤模型,应用免疫组化检测小鼠中脑黑质区DA神经元的损伤以及小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。结果：1.T2D小鼠肝脏和胰腺内的炎症反应显著增强T2D小鼠外周血中胰岛素和血糖水平显著增高(P<0.01)；胰岛呈代偿性肿大,肝脏发生明显的脂肪变性和炎症细胞浸润；血清中的炎症因子IL-1β、IL-6、 IL-18和TNF-α的水平显著升高(P<0.01)；T2D小鼠肝脏中的胰岛素受体通路相关蛋白AKT和ERK的磷酸化水平发生显著的下调(P<0.05)。2.T2D小鼠中脑α-synuclein表达增加、内质网应激反应增强T2D小鼠中脑和胰腺组织α-synuclein蛋白和mRNA的表达均较WT小鼠显著增加(P<0.05)；并且在T2D小鼠中脑和胰腺组织中,内质网应激相关蛋白CHOP和GRP78的表达水平显著高于WT小鼠(P<0.05)。3.T2D小鼠中脑小胶质细胞显著活化两种T2D小鼠中脑SNc和VTA区DA神经元和星形胶质细胞数量与WT小鼠无显著差异,但中脑SNc和VTA区小胶质细胞数量显著增加、呈活化的阿米巴样形态(P<0.05)。4.T2D小鼠中脑炎症反应增加、神经营养因子表达下调、胰岛素受体信号通路异常T2D小鼠中脑促炎因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的表达显著增加,抑炎因子IL-4和IL-10的水平显著下调,NF-κB p65亚基的核转位以及炎症小体的激活均显著增加(P<0.05)；T2D小鼠胰腺和中脑内的神经营养因子BDNF和IGF-1的表达显著下调(P<0.01)；T2D小鼠中脑胰岛素受体通路相关蛋白AKT-GSK和MAPK p38-ERK的活化也受到显著抑制(P<0.05)。5.T2D小鼠对MPTP神经毒性的敏感性增强慢性MPTP/p PD模型制备过程中,db/db小鼠死亡率显著增强；急性MPTP损伤模型组db/db小鼠中脑黑质DA神经元的丢失显著增加(P<0.01),星形胶质细胞和小胶质细胞均较WT小鼠活化更加显著(P<0.01)。结论：T2D小鼠中脑α-synuclein表达显著上调,导致内质网应激和炎症反应显著增强,因而加重了MPTP所诱导的中脑神经损伤。第二部分α-synuclein对小胶质细胞介导的炎症反应的影响目的：研究α-synuclein对小胶质细胞介导的炎症反应的影响。方法：应用WT和A53Ttg/-α-synuclein过表达小鼠制备慢性MPTP/p PD模型(MPTP20mg/kg,s.c.,丙磺舒250mg/kg,i.p.,2次／周,连续5周),应用免疫组化检测WT和A53Ttg/-小鼠中脑内DA神经元、星形胶质细胞以及小胶质细胞在模型制备前后的差异；应用小鼠源性的小胶质细胞株BV-2,外源性给予WT/A53T α-synuclein蛋白,通过western blotting检测BV-2细胞产生IL-1p信号通路相关蛋白NF-κB(p65)、NLRP3、(pro)caspase-1以及(pro) IL-1β的表达；通过ELISA检测caspase-1抑制剂zYVAD对WT/A53T α-synuclein所诱导IL-1p表达的影响;应用细胞免疫荧光实验和激光共聚焦成像观察细胞松弛素D对BV细胞吞噬α-synuclein作用的影响：通过western blotting测定进入BV-2细胞内α-synuclein的含量、caspase-1的活化以及自噬相关蛋白p-AMPK/AMPK以及LC-3Ⅰ/Ⅱ的表达；应用溶酶体荧光染料Lyso-Tracker Red标记BV-2细胞的溶酶体,通过共聚焦显微镜记录溶酶体形态的变化；应用western blotting检测细胞内组织蛋白酶B的表达；应用AMPK激动剂AICAR刺激细胞,荧光标记观察细胞ROS的产生,western blotting测定caspase-1的表达,ELISA测定IL-1p的产生。结果：1. α-synuclein过表达加重了慢性MPTP/p所诱导的小鼠中脑神经损伤基础状态下,过表达α-synuclein的A53Ttg/-小鼠与WT小鼠中脑黑质DA神经元和星形胶质细胞的数目无显著差异,但小胶质细胞活化显著(P<0.05)。急性MPTP导致A53Ttg/-小鼠中脑黑质DA神经元丢失较WT小鼠更显著(P<0.01),星形胶质细胞和小胶质细胞的活化也显著增加(P<0.05)。2.外源性α-synuclein激活BV-2细胞中IL-1p生成的信号通路外源性α-synuclein增加NF-κB p65亚基核转位和NLRP3炎症小体的激活,促进IL-1β的产生(P<0.05)。caspase-1特异性抑制剂zYVAD可逆转α-synuclein所诱导的IL-1p的生成(P<0.05)。3. α-synuclein通过细胞吞噬作用进入BV-2细胞α-synuclein通过细胞吞噬作用进入BV-2细胞；细胞松弛素D抑制BV-2细胞对α-synuclein的吞噬作用,下调α-synuclein所诱导的caspase-1的活化和IL-1β的产生(P<0.01)。4. α-synuclein抑制BV-2细胞的自噬并影响溶酶体的形态和功能外源性α-synuclein抑制小胶质细胞噬自相关蛋白p-AMPK和LC-3Ⅱ的表达(P<0.05)；外源性α-synuclein使溶酶体发生肿胀、增加组织蛋白酶B从溶酶体内的释放(P<0.05)。5.AICAR通过激活AMPK逆转α-synuclein所诱导的自噬障碍和炎症反应AMPK激动剂AICAR促进小胶质细胞AMPK的激活(P<0.01),上调LC-3Ⅱ的表达(P<0.01)、抑制a-synuclein所诱导的ROS产生(P<0.01)和NLRP3炎症小体的激活,进而减少IL-1p的产生(P<0.05)。结论：a-synuclein过表达促进小胶质细胞的活化,加重慢性MPTP/p所致的中脑DA神经元的损伤；外源性a-synuclein通过小胶质细胞吞噬作用进入BV-2细胞,抑制细胞自噬和溶酶体功能、激活IL-1p信号通路而加重炎症反应。第三部分β-synuclein对星形胶质细胞介导的炎症反应及其营养因子表达的影响目的：研究a-synuclein对星形胶质细胞介导的炎症反应、营养因子的表达以及DA受体激动剂抑炎作用的影响。方法：应用出生1-3天的WT和A53Ttg/tg新生小鼠分离培养原代中脑星形胶质细胞；应用western blotting,检测基础状态下,以及给予Mpp+刺激并用D1/2激动剂SKF38393和quinpirole药物处理后,WT和A53Ttg/tg中脑星形胶质细胞NLRP3、(pro)caspase-1和(pro)IL-1β以及营养因子BDNF、GDNF和FGF-2的表达；Mpp+刺激WT和A53T星形胶质细胞并给予D1/2激动剂,WT和A53Ttg/tg中脑星形胶质细胞p-AKT/AKT,p-P38/P38,p-ERK/ERK的表达。结果：1.A53Ttg/tg星形胶质细胞营养因子表达显著下调、炎症小体活化增加A53Ttg/tg中脑星形胶质细胞营养因子BDNF和GDNF的表达显著低于WT星形胶质细胞(P<0.05),而caspase-1的活化和IL-1p的表达显著增加(P<0.05)。2. a-synuclein过表达取消D1/2激动剂上调WT星形胶质细胞营养因子的表达的作用D1/2激动剂显著上调WT星形胶质细胞BDNF,GDNF和FGF-2的表达(P<0.05),而对A53Ttg/tg星形胶质细胞营养因子的表达无显著影响。3. a-synuclein过表达取消D1/2激动剂对Mpp+所致WT星形胶质细胞营养因子表达的下调和炎症小体的激活的抑制作用MPP+诱导WT星形胶质细胞NLRP3、caspase-1和IL-1p的表达显著上调(P<0.05),抑制营养因子BDNF、GDNF和FGF-2的表达(P<0.05)。D1/2激动剂显著地抑制MPP+所诱导的炎症小体的激活(P<0.05),减少IL-1p的产生(P<0.05),并能促进WT星形胶质细胞营养因子的表达(P<0.05)。在A53Ttg/tg星形胶质细胞中,D1/2激动剂的抑炎和促营养因子表达作用被取消。4. α-synuclein过表达取消D1/2激动剂激活星形胶质细胞内DA受体信号通路的作用MPP+刺激下的WT星形胶质细胞给予D1/2激动剂后,DA受体通路D1R-p38以及D2R-AKT-ERK被激活(P<0.05),而在A53Ttg/tg星形胶质细胞中,D1/2激动剂不能改善MPP+所诱导的DA受体通路相关蛋白的失活状态。结论：α-synuclein过表达抑制星形胶质细胞营养因子的表达、增强炎症反应；并取消了D1/2激动剂对星形胶质细胞的促营养因子表达及抗炎作用。综上所述,本文工作的主要创新之处在于：1.代谢性炎症通过促进神经炎症加重中脑对神经毒素的易感性本文研究发现代谢性炎症通过促进脑内炎症反应,加重MPTP所致的中脑神经损伤,为代谢性炎症与PD的相关性提供了直接的实验证据。2. α-synuclein通过激活炎症小体进而促进小胶质细胞的活化通过在体和离体研究,阐明α-synuclein通过细胞吞噬作用进入小胶质细胞,激活NLRP3炎症小体上调IL-1p的表达,从而促进小胶质细胞的活化,加重MPTP/p所致的神经损伤。研究结果为靶向神经炎症的药物用于PD的临床治疗提供了理论依据。3. α-synuclein过表达取消了DA受体激动剂的抑炎和促营养支持作用α-synuclein过表达增强星形胶质细胞内的炎症反应,并且抑制其营养因子的表达。α-synuclein通过阻断DA受体通路相关蛋白的激活从而抑制DA受体激动剂的抗炎和营养支持作用,为深化对PD的发生发展及临床治疗学认识积累了重要的学术基础。