松江鲈(Trachidermus fasciatus)全基因组序列分析及盐度适应机制初探

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鱼类的渗透调节是一项重要的动态平衡过程,对鱼类的生存具有极其重要的意义。但到目前为止,关于鱼类盐度适应机制的研究进展仍处于起步阶段。松江鲈(Trachidermus fasciatus)为河海洄游性鱼类,适盐范围广,本研究拟选择松江鲈作为研究对象,开展鱼类盐度适应机制的研究。本论文首次开展了松江鲈鱼的全基因组测序,利用生物信息学技术对其进行了组装注释,评估了基因组质量,分析了基因组结构、蛋白编码基因构成及其特征,从比较基因组角度,对松江鲈基因组中发生显著扩张与收缩基因家族类别和受正选择基因进行了鉴定和功能解析,筛选出盐度耐受相关的基因,为进一步研究其盐度适应的基因组学机制奠定基础;同时开展了盐度胁迫下松江路各组织的转录组学分析,获得了松江鲈丰富的转录组信息,筛选和鉴定了盐度适应相关候选基因,并对既发生扩张与收缩或受到正选择,又在盐度胁迫下差异表达的盐度耐受关键基因进行了进一步的解析,主要研究结果如下:1.采用de novo测序技术对松江鲈基因组序列进行测定,通过Wtdbg2软件对基因组序列进行组装,获得了完整的松江鲈基因组序列。组装获得松江鲈的基因组大小为556Mb,Contig N50评估长度达10Mb以上,BUSCO评估结果表明,松江鲈基因组完整度在真核生物基因集中达94.4%,在后生动物基因集中达97.3%,证明组装获得的基因组质量较高。通过RepeatMasker等软件对松江鲈基因组中的重复序列进行注释,结果表明:通过de novo从头预测以及蛋白质水平和核苷酸水平的预测,共注释出125M的重复序列,占整个基因组大小的22.54%,其占比与其它鱼类(三刺鱼25,2%、花鲈19.76%、小黄鱼19.03%等)相似。采用同源比对和de novo从头预测相结合,在松江鲈基因组中共注释到19,499个蛋白质编码基因,对这些基因进行功能注释,结果表明97.7%的基因可在InterPro、TrEMBL、GO、KEGG、Swissprot、COG六大功能基因库中被成功注释,剩下441个未能被注释的基因可能为松江鲈的特有基因。本研究获得的松江鲈基因组信息,为下一步采用比较基因组学研究筛选其盐度耐受候选基因打下了良好的基础。采用软件OrthoMCL1.4将松江鲈与许氏平鲉、黄尾鰤、大黄鱼、条石鲷、赤点石斑鱼和斑马鱼进行基因家族的聚类分析,并利用RAxML8.0.8对单拷贝基因家族的比对序列进行系统发育树的构建,结果表明松江鲈鱼和许氏平鮋的关系最为接近。使用PAML4当中的codeml工具检测在松江鲈中受到正选择的基因,最终鉴定出405个候选基因,并且基于前人的研究结果我们筛选出30个与渗透压调节应有关的基因,其中包括热休克蛋白70(Heat shock protein 70,Hsp70)、渗透胁迫转录因子1(Osmotic stress transcription factor 1,OSTF1)、类胰岛素生长因子1(Insulin-like growth factor,IGF-1)、类胰岛素生长因子结合蛋白1(Insulin-like growth factor-binding protein1,IGFBP-1)、紧密连接蛋白4(Claudin-4)、液泡ATP酶(Vacuolar-typeH+-ATPase,V-ATPase)等,这些基因可能对于松江鲈在适应环境渗透压改变的过程具有重要的调控作用。2.通过高通量转录组测序技术,对盐度胁迫下松江鲈脑,鳃,肠,肾4种组织转录组进行分析,并与对照组进行比较,筛选和鉴定盐度胁迫后差异表达的基因。结果表明:与对照组相比,脑、鳃、肠、肾等组织分别出现了7915(上调3155/下调4760)、2517(上调758/下调1759)、2394(上调1304/下调1090)、1707(上调618/下调1089)个差异表达基因。GO功能和KEGG通路富集分析综合显示:脑组织中显著差异表达基因主要富集在激素分泌、突触传递、离子通路等信号传递通路上,与之相关的基因如生长激素(Grouth hormone,GH)、碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase,CA)、血清/糖皮质激素调节激酶1(Serum/glucocorticoid-regulated kinase 1,SGK1)等基因的表达均发生了显著上肠组织中显著差异表达基因主要富集在蛋白、肽类、氨化物代谢等通路上,与之相关的基因如IGFBP-I的表达发生了显著上调,脂肪酸结合蛋白6(Fatty acid-binding protein 6,FABP)发生了显著下调;鳃组织中显著差异表达基因主要富集糖代谢、免疫应答、吞噬、凋亡等通路上,与之相关的基因如Na+/K+ATP(NKA)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)等基因的表达发生了显著上调;肾组织中显著差异表达基因主要富集在细胞因子互作、免疫应答以及受体结合等通路上,与之相关的基因如催乳素受体(Prolactin receptor,PRLR)、生长停滞与DNA损伤-诱导蛋白45β(growth arrest and DNA damage inducible protein 45β,GADD45β)等基因的表达均发生了显著上调,该结果暗示脑、鳃、肠、肾等四种组织都在松江鲈的盐度胁迫中起着重要的作用。3.将前章得到的发生扩张或收缩以及受正选择的渗透压调节相关基因与差异表达基因结果进行比对,得到23个既显著改变又在胁迫实验中差异表达的盐度相关基因,包括V-ATPase、Claudin-4、Hsp70、IGFBP-I、AQP1等常见基因,并且已在诸多研究中被作为生物标记用来探究鱼类应对环境渗透压的改变的响应机制,推测这些基因为松江鲈盐度适应性进化过程发挥作用的关键基因。4.本论文首次完成了松江鲈的全基因组组装注释和完成了转录组测序,对松江鲈耐盐基因进行了筛选,并对其耐盐调控机制做出了解析,这将为有关松江鲈的基因组学,转录组学以及分子生物学方面的研究提供相应的数据支持,同时为今后松江鲈及其它鱼类广盐品系的选育打下坚实的理论基础。
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