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先天性心脏病(先心病)是目前最常见的一种出生缺陷,并发症较多,严重威胁患儿的生命,对社会和家庭造成了极大的影响。已有研究表明,遗传因素和环境因素是导致先心病的两大主要致病因素。这两种因素单独作用或者相互作用均可使胚胎心脏发育异常。因此,深入研究先心病的发病机制以控制其发病率显得极其重要。大量的研究发现,香烟中的尼古丁和环境中无处不在的双酚A均可对心血管疾病以及胚胎发育产生影响。本课题组前期的研究表明,孕期大鼠给予高剂量的尼古丁能够导致子代大鼠心脏间隔缺损,可能与心脏特性转录因子GATA4、TBX5启动子区域DNA的甲基化升高有关,为了进一步探索尼古丁和双酚A可能引起先心病的分子机制,我们开展了以下研究。研究方法:1、通过单层分化的方法,诱导人胚胎干细胞hESC-H9定向分化为心肌细胞,并将其作为体外胚胎心脏发育的模型。通过探索最佳的分化条件,使胚胎干细胞能高效而稳定地分化为成熟的、有自动节律的心肌细胞。2、通过CCK-8实验确定尼古丁干预分化过程的最适浓度,观察不同浓度的尼古丁对干细胞心肌分化的影响,采用荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质印记(Westernblot)、免疫荧光等方法检测分化过程中心脏特异性转录因子表达量的改变。3、通过细胞形态学的改变和CCK-8实验,确定尼古丁和双酚A混合物干预干细胞心肌分化的最适浓度。采用Western blot检测分化不同时间点心肌细胞标志物的蛋白表达,并用RT-qPCR检测分化第3天、第7天和第14天不同浓度混合物对胚胎干细胞干性指标Nanog、Sox2、Oct4的影响,并筛选出变化明显的miR-125b作为后续分子机制的研究对象。4、通过给予miR-125b-mimic和miR-125b-inhibitor来进行过表达和抑制功能实验,进一步证实在分化过程中miR-125b和Lin28的靶向关系,以及对分化的影响。研究结果:1、hESC-H9能高效并稳定地分化为有自动节律跳动的心肌细胞的首要条件是在干细胞的汇合度达到85%左右时进行分化实验,干细胞汇合度过低或者过高都会极大影响分化结果。此方法可以使无饲养层的hESC-H9不经过拟胚体阶段直接分化形成成熟的心肌细胞。这些心肌细胞有明显的自动节律性,并能高表达成熟心肌细胞的分子标志物c-TnT、c-TnI、MHC等。2、尼古丁能延长hESC-H9定向心肌分化过程的时间,减少自发跳动的心肌细胞的数量、范围和频率,以高浓度组(100 μM)的尼古丁干预组现象更显著。不同浓度的尼古丁干预分化过程时,100 μM浓度的尼古丁能显著减低分化第3天中胚层特异性标志物Mesp1和Brachyury的蛋白表达水平。我们初步推测尼古丁延长hESC-H9定向心肌分化时间是通过抑制分化过程中中胚层的形成来实现的。在分化第14天时,我们发现尼古丁能剂量依赖性的降低心肌特异性转录因子GATA4和Tbx5的mRNA表达水平,因此我们进一步推测尼古丁抑制定向心肌分化是通过抑制GATA4和Tbx5来实现的。3、尼古丁和双酚A(N+B)混合物能抑制hESC-H9定向心肌分化,以高浓度组(10μM)抑制作用最明显。首先通过RT-qPCR筛选出hESC-H9定向心肌分化过程中变化最为显著的三种miRNA(miRNA-1、miRNA-134和miR-125b),其次发现不同浓度N+B混合物(0.1μM、1μM、10μM)处理分化过程后,与对照组相比,在分化的不同时间段能上调干性标志物Nanog、Oct4、Sox2的mRNA的表达量,而miRNA-134的表达水平却明显下降;通过过表miR-125b功能实验发现,与对照组相比,N+B高浓度组(10μM)在分化的第7天和第14天均能显著抑制其靶基因Lin28的mRNA表达水平。通过miR-125b缺失功能实验发现,与未转染组(0D-CT)相比较,未分化的hESC-H9转染组(0D-inhibitor)中Lin28的mRNA表达水平显著增加。从分化开始到分化的第7天,Lin28的mRNA表达量随时间不断增加,但相对于未给药的转染组(CT-inhibitor),高浓度转染组(10μM-inhibitor)能降低Lin28的mRNA表达量,并有统计学差异。4、研究结论:本研究首先探索了直接、稳定和高效的单层定向心肌分化方法,使人胚胎干细胞最终形成自发性跳动地成熟心肌细胞。根据实验结果,我们推测尼古丁可能通过延缓中胚层的形成以及降低心肌特异性转录因子GATA4和Tbx5的水平来达到抑制心肌分化的作用。高浓度的N+B混合物(10 μM)抑制心肌分化的机制可能有以下两个方面,一是通过抑制miRNA134的表达,上调分化过程中细胞干性标志物的表达,导致细胞牵制在干性状态,进而抑制了心肌分化;二是通过miR-125b/Lin28的途径来抑制心肌分化。