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目的:曲细精管内干细胞移植技术为研究体内干细胞迁移、增殖和分化发生机制提供一个平台,为临床治疗男性不育提供新的治疗思路。本实验尝试将小鼠孤雌胚胎干细胞移植到受体小鼠曲细精管内,以观察供体细胞体内迁移、定植和分化的能力。 方法:对4~6周龄ICR雄性小鼠进行白消安注射以建立小鼠无精子症模型,A组腹腔内单次注射白消安(40mg/kg),B组腹腔内单次注射等剂量二甲基亚砜溶剂,C组腹腔内单次注射等剂量生理盐水(对照组);以携带绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)的小鼠孤雌胚胎干细胞(pathenogenetic embryonic stemcells,PgES cells)为供体细胞;以白消安建模组和正常同系未注射白消安组小鼠为受体小鼠;采用曲细精管注射法将供体PgES细胞分别移植到两种受体小鼠单侧睾丸中,对侧睾丸曲细精管内注射等量磷酸盐缓冲液(phosphate buffersaline,PBS)作为阴性对照,对移植后的受体小鼠睾丸分两个时间段(早期:立即-8周;晚期:9周-14周)进行形态学检测,并通过GFP免疫组化和免疫荧光的追踪分析,观察移植的供体PgES细胞在曲细精管内的迁移,定植和分化情况。 结果:腹腔注射4周后,A组小鼠睾丸重量明显低于B组和C组(P<0.001);HE染色结果显示,B组和C组生精上皮结构正常,可见各级生精细胞,A组在4周至8周时曲细精管内源性生精细胞被破坏,失去正常的生精上皮结构,各级精原细胞逐渐消失;在12周至14周时生精上皮结构逐渐恢复正常,可见精原细胞,生育能力实验显示5只小鼠中有4只(80%)恢复了生育能力。曲细精管内移植PgES细胞后,早期取材HE染色结果显示,建模组有16例(16/18,88.89%)睾丸组织形态无明显改变,有正常生精上皮结构,部分管腔中空,各级精原细胞较少,随着注射时间的延长睾丸恢复精子发生过程,各级生精细胞逐渐恢复,而未注射白消安组仅有3例(3/12,25%)曲细精管结构清晰,生精上皮结构正常,管腔内可见各级精原细胞。未注射白消安组移植后立即取材检测GFP免疫组化和免疫荧光,结果显示个别管腔中有散在阳性细胞表达。建模组移植PgES细胞1周后,GFP免疫组化和免疫荧光结果显示小鼠多个曲细精管管腔中分布着阳性细胞;在移植后2周到4周,GFP免疫组化可见管腔中存在阳性细胞,但免疫荧光结果未检测到阳性细胞。建模组移植PgES细胞晚期,有11例(11/22,50%)小鼠睾丸外观异常膨大,颜色较正常睾丸变深,包膜完整,表面可见清晰血管,进一步进行组织学检测,HE染色结果显示组织中含有三个胚层的结构,包括:神经管,角质层(外胚层),肌纤维,血液和软骨(中胚层)及呼吸管(内胚层);有7例(7/22,31.82%),HE染色结果显示睾丸组织形态正常,结构清晰,有正常睾丸曲细精管的结构,各级生精细胞基本恢复;对晚期组织进行免疫组化和免疫荧光检测,结果显示均未检测到阳性细胞。 结论:建模组比未建模组更利于观察细胞的迁移、定植和分化情况,更适合作为移植的受体模型。曲细精管内移植PgES细胞后,细胞可在建模组受体的管腔中定植4周。