羧基化单壁碳纳米管对斑马鱼胚胎及幼鱼的毒性效应研究

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目的:(1)明确羧基化单壁碳纳米管(carboxylated single-walledcarbon nanotubes,SWCNT-COOH)的物理化学性质;(2)研究SWCNT-COOH不同给药方式对斑马鱼胚胎和幼鱼的毒性作用,并探讨其可能的毒性效应机制,为SWCNT-COOH在生物医学方面的应用提供毒性依据。  方法:(1)通过浓混酸处理(H2SO4∶HNO3=3∶1,V/V)、超声剪切、透析和超滤等手段对SWCNT-COOH进行氧化、剪切和纯化,以激光拉曼光谱仪(Raman)、紫外-可见分光光度计(UV-Vis)、透射电子显微镜(TEM)、激光纳米粒度仪(LPSA)和电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)对SWCNT-COOH的纯度、表面形貌、粒径分布、金属杂质含量等方面进行表征。(2)设立6个药物浓度组,分别为未去膜组(空白对照、40 mg/L、80 mg/L、160 mg/L)与去膜组(空白对照、40 mg/L、80 mg/L、160 mg/L),从8hpf开始染毒,然后置于28℃恒温培养箱控光培养至72hpf。ELISA法检测SWCNT-COOH对斑马鱼胚胎IL-1β和TNF-α表达的影响;运用实时荧光定量PCR仪检测与骨骼发育相关基因BMP2b、BMP4、runx2a及runx2b mRNA的相对表达量。(3)4dpf的斑马鱼被分为4个组,分别为空白对照、40mg/L、80 mg/L和160 mg/L,以SWCNT-COOH进行染毒,置于28℃恒温培养箱控光连续培养至6 dpf。采用TEM、HE染色及荧光蛋白消化法观察评价SWCNT-COOH对6dpf斑马鱼幼鱼消化道的影响。(4)将48 hpf的MPO品系斑马鱼幼鱼分为空白对照组、溶剂对照组和3个剂量组:D/10、D/3、D(D=40ngSWCNT-COOH),通过卵黄囊注射SWCNT-COOH进行染毒,观察SWCNT-COOH对斑马鱼中性粒细胞形成的影响,直到6dpf。以同样的方法将48 hpf的MPO品系斑马鱼幼鱼分为空白对照组、溶剂对照组和3个剂量组,并设置3个观测时间:注射后4小时(4 hpi)、注射后20小时(20 hpi)和注射后24小时(4 hpi),观察SWCNT-COOH诱发的斑马鱼炎症反应。  结果:(1)经纯化后得到了分散性好、稳定、粒度均一性好和金属杂质含量低的SWCNT-COOH。(2)与空白对照组相比,SWCNT-COOH对去膜和未去膜斑马鱼胚胎炎症细胞因子IL-1β和TNF-α的含量均无影响;SWCNT-COOH染毒后,未去膜组中斑马鱼胚胎基因BMP2b、BMP4、runx2a和runx2b mRNA的表达水平未发生改变,去膜组中上述基因mRNA略下调,但与空白对照组相比差异无统计学意义。(3)与空白对照组相比,各染毒组的斑马鱼幼鱼胃肠道上皮绒毛均出现不同程度的脱落与肿胀,其中高剂量组受影响程度最大,肠道内可见团聚的SWCNT-COOH;空白对照组的胃肠道上皮绒毛排列整齐完好,而高剂量组(160mg/L)则出现绒毛脱落现象。(4)与溶剂对照组比较,各处理组定量评价区域中性粒细胞数量差异均没有统计学意义(P>0.05);在4hpi、20 hpi和24 hpi,与溶剂对照组比较,各处理组定量评价区域中性粒细胞数量均没有差异无统计学意义(P>0.05)。  结论:(1)建立了纯化和表征SWCNT-COOH的方法。(2)在剂量范围内,SWCNT-COOH对斑马鱼胚胎无致炎作用和骨毒性影响,预示SWCNT-COOH潜在的胚胎毒性较低或基本无毒。(3)揭示了SWCNT-COOH对斑马鱼胃肠道具有潜在的毒性影响,对消化道上皮微绒毛有一定的损伤作用并影响消化功能。(4)卵黄囊注射的SWCNT-COOH对斑马鱼中性粒细胞的形成和趋化无影响,表现出低的免疫毒性。
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