第一部分双酚A、三氯生和壬基酚在尿液和卵泡液中的浓度及其和临床结局的相关性分析背景和目的:环境内分泌干扰物(Environmental Endocrine Disruptors,EEDs)是环境中一类能模拟或抑制内源性激素的活动,并改变内分泌系统功能的化合物。许多化合物虽然已经生产了数十年,但是仅在近年才发现其有类激素活性,称为新生的EEDs(Emerging EEDs)。如广泛应用于日用品如牙膏或婴儿护理品中的三氯生(Triclosan,TCS),塑料制品中的双酚A(Bisphenol A,BPA),以及洗涤剂或水性漆中的正壬基酚(nonylphenol,4-n-NP)等。BPA,TCS和4-n-NP都具有和雌激素类似的化学结构,且它们都具有微弱的雌激素活性。雌激素是女性生殖系统的重要调控激素,其水平的异常可以导致女性生殖系统的多种疾病。女性生殖系统是EEDs高敏感靶器官之一,但既往的研究主要集中于传统的EEDs,据我们所知,目前仍没有TCS和4-n-NP与女性生殖功能障碍关系的临床研究报道,BPA虽有少量临床报道但存在争议。因此急需人群研究来阐明BPA,TCS和4-n-NP与女性生殖功能障碍的相关性。本部分研究旨在探索我国育龄妇女中BPA,TCS和4-n-NP的暴露水平,明确我国育龄妇女这些新生EEDs的暴露与胚胎种植、受精率、优胚率等临床结局的关系。材料和方法:1.从生殖医学中心收集取卵日单纯管性不孕IVF-患者的卵泡液281例和尿液219例。2.高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)测量尿液中BPA,TCS和4-n-NP的浓度和卵泡液中BPA和TCS的浓度。3.统计分析(t检验、t’检验、Pearson相关分析)患者尿液和卵泡液中的BPA,TCS,4-n-NP浓度与患者的临床结局的相关性。临床结局包括:OHSS高危、取卵日子宫内膜类型、直径大于14mm卵泡数目、获卵数、卵裂率、取卵日子宫内膜厚度、优胚率、受精率、促排卵天数、正常受精数(2PN)、早产/足月产、单胎性别、单胎、胚胎种植率。结果:1.尿液样本EEDs平均浓度经尿肌酐校正后为:BPA l.1±2.40μg/g肌酐,TCS 5.59±28.09μg/g 肌酐,4-n-NP 0.065±0.198μg/g 肌酐。BPA,TCS,4-n-NP 的检出率分别为83.2%,90.7%,51.1%。卵泡液样本EEDs平均浓度为:BPA 0.54±0.94 ng/ml,TCS 0.40±1.10 ng/ml。BPA和TCS在卵泡液中的检出率分别为50.3%和 35.2%。2.统计分析结果显示:(1)尿液和卵泡液中BPA,TCS,4-n-NP的浓度与OHSS高危、直径大于14mm卵泡数目、获卵数、卵裂率、取卵日子宫内膜厚度、优胚率、受精率、促排卵天数、正常受精数(2PN)、早产/足月产、单胎性别没有相关性(P>0.05);尿液中BPA、TCS、4-n-NP浓度及卵泡液中TCS浓度与取卵日子宫内膜类型没有相关性(P>0.05);尿液和卵泡液中TCS和BPA的浓度与单胎没有相关性(P>0.05);尿液和卵泡液中TCS与胚胎种植率没有相关性(P>0.05)。(2)高种植率患者尿液BPA平均浓度显著低于低种植率患者(P<0.001;t’检验),尿液BPA浓度较高患者的平均种植率显著低于尿液中BPA浓度较低的患者(P<0.01;t’检验)。(3)A型子宫内膜患者卵泡液中BPA平均浓度显著低于B型子宫内膜患者(P<0.05;t 检验)。(4)高种植率患者尿液4-n-NP平均浓度显著低于低种植率患者(P<0.01;t’检验)。(5)单胎妊娠患者尿液中4-n-NP浓度显著高于双胎妊娠患者(P<0.01;t’检验)。结论:1.BPA暴露可干扰胚胎成功植入子宫内膜的过程。2.BPA暴露可能通过影响子宫内膜的容受性而导致胚胎植入子宫成功率的下降。3.4-n-NP暴露可能降低双胚胎种植能力。第二部分小鼠模型研究双酚A和三氯生对子宫蜕膜化和胚胎着床的影响背景和目的:胚胎的成功种植是人类生殖过程中的关键步骤,子宫内膜容受性的建立是胚胎种植的重要前提条件,子宫内膜的蜕膜化是子宫内膜容受性的重要部分。既往研究发现胚胎种植前暴露高浓度的BPA和TCS可以影响小鼠的胚胎种植,但是此类动物模型使用的暴露剂量均远高于环境暴露水平,而有关BPA和TCS对子宫的蜕膜化有影响,仅限体外细胞水平的实验证据,尚无整体的体内研究和深入的分子机制研究。本研究第一部分人群研究的结果显示BPA暴露可影响IVF患者新鲜胚胎移植后胚胎种植率,其机制可能通过改变种植期子宫内膜的构型而导致其容受性的下降。故此,建立环境相关剂量的BPA和TCS小鼠染毒模型,拟在整体水平考察明确环境相关剂量BPA和TCS对胚胎种植和子宫内膜蜕膜化的作用和机制。材料和方法:1.建立环境相关剂量早孕染毒小鼠模型,见栓日上午定义为胚胎日0.5(embryo day0.5,E0.5),于 E0.5-3.5 每天上午灌胃 BPA0,1,10,100ug/kg/天,或 TCS 0,1,10,100mg/kg/天。每天上午称量母鼠体重,在E6时处死母鼠,取出子宫统计胚胎种植点数目。2.建立油诱导的蜕膜化染毒小鼠模型,见栓日上午定义为假孕日0.5(pseudopregnant day 0.5,PPD 0.5),于 PPD 0.5-3.5 每天上午灌胃并测量体重,灌胃剂量为 BPA0,100,1000,10000ug/kg/天,或 TCS0,1,10,100mg/kg/天。PPD4时单侧子宫注射玉米油诱导小鼠子宫蜕膜化,诱导后3天(PPD7)处死母鼠,称量并统计蜕膜化侧子宫重量改变倍数。3.取油诱导的蜕膜化小鼠模型子宫,用HE染色检测组织形态,免疫组化和免疫荧光检测蜕膜化相关分子Desmin的表达。结果:1.比较对照组,E0.5-3.5环境相关剂量BPA和TCS暴露组雌性小鼠E6时小鼠种植点数目显著下降(P<0.001),且其下降水平呈BPA和TCS剂量依赖性效应。2.环境相关剂量的 BPA(100-10000ug/kg/day)和 TCS(1-100mg/kg/day)暴露雌性小鼠的油诱导的母鼠子宫蜕膜化水平显著性低于对照组(P<0.01)。3.HE染色提示环境相关剂量的BPA(100-10000ug/kg/day)和TCS(1-100mg/kg/day)暴露可影响母鼠子宫血管生成。4.免疫组化和免疫荧光显示环境相关剂量的BPA(100-10000ug/kg/day)暴露显著下调了油诱导的蜕膜化染毒小鼠模型中蜕膜细胞的蜕膜化分子标志物Desmin 表达。结论:1.首次在整体水平证明环境相关剂量BPA和TCS暴露可以影响小鼠胚胎植入子宫内膜的成功率。2.环境相关剂量BPA和TCS暴露影响小鼠胚胎植入子宫内膜机制涉及BPA和TCS对小鼠子宫内膜蜕膜化过程的干扰。3.环境相关剂量的BPA和TCS暴露可影响小鼠子宫蜕膜化过程中的血管生成并干扰正常子宫蜕膜化过程,进而减低胚胎植入子宫内膜的成功率。第三部分 小鼠和细胞模型研究双酚A和三氯生影响子宫蜕膜化和胚胎着床的分子机制背景和目的:子宫内膜蜕膜化异常可以导致胚胎种植失败早已定论,报道有关的蜕膜化异常和子宫内膜容受相关的蛋白有LIF、Integrinβ3、DKK1、Claudin4、EGFR、SGK1、ENaC、p53、HOXa10、PR、ER等等,但有关BPA和TCS暴露影响小鼠的子宫蜕膜化和胚胎种植的相关分子生物学改变却基本仍为空白。旨在我们已经发现的环境剂量BPA和TCS通过影响小鼠子宫蜕膜化过程降低胚胎种植率的基础上,探索其内在的分子生物学机制,我们进行了染毒小鼠子宫内膜、染毒体外培养细胞的基因表达及其调节改变的分子机制研究。材料和方法:1.RNA测序检测BPA和TCS早孕染毒小鼠模型E4时的子宫内膜基因表达改变,并进行KEGG分析。2.通过SRB增殖实验检测BPA和TCS对IK细胞的增殖毒性,并查阅相关文献确定IK细胞染毒模型的BPA和TCS的暴露量。3.使用早孕染毒小鼠模型E4和E6时的母鼠子宫和蜕膜化染毒小鼠模型的母鼠子宫等材料以及IK细胞染毒模型,使用RT-PCR,western-blot,免疫组化,抗体芯片等分子生物学技术,研究BPA和TCS对子宫内膜容受性相关的基因在RNA水平和蛋白水平的影响。结果:1.RNA测序发现:BPA和TCS影响了 PI3K/AKT通路的多个基因的转录水平。2.BPA暴露对早孕染毒小鼠模型中E4时的子宫内膜容受性相关基因SGK1,LIF,ENaCα,ENaCβ,p53,ERα,HOXa10的mRNA水平没有显著性影响。但E6时,高浓度(100ug/kg/day)BPA可显著性上调ERα,HOXa10和claudin4的基因转录水平,而SGK1,LIF,ENaCα,ENaCβ,ENaCy,p53的基因的表达仍无显著性变化。3.TCS暴露对E4时的子宫内膜容受性相关基因SGK1,LIF,ENaCα,ENaCβ,p53,ERα,HOXa10的mRNA水平也无显著性影响。但在E6时,10-100mg/kg/day TCS可显著性上调SGK1基因的转录水平,而LIF,ENaCα,ENaCβ,ENaCy,p53,ERα,HOXa10,claudin4的mRNA水平仍基本保持稳定。4.Western blot检测提示:早孕染毒小鼠模型中BPA暴露下调了 E4和E6时母鼠子宫内膜SGK1的蛋白水平。免疫组化显示:环境相关剂量的BPA暴露(100-10000ug/kg/day)可以显著下调油诱导的小鼠蜕膜化染毒模型中蜕膜化子宫的腔上皮细胞的SGK1和ENaCα的表达。5.SRB检测显示100ug/ml以上的BPA和10ug/ml以上的TCS对IK细胞的增殖有显著影响。但是1ug/ml及以下的BPA和TCS对IK细胞的增殖没有发现显著影响。6.Western blot 显示 0.001-1ug/ml BPA 暴露 24 小时后,IK 细胞的 ENaCα、SGK1、pSGK1的蛋白水平下调了且BPA对SGKI的下调可以被雌激素受体拮抗剂fulvestrant逆转。但BPA的暴露没有影响LIF和ENaCy的蛋白表达。7.抗体芯片结果显示BPA对IK细胞中PI3K/AKT通路的关键蛋白(Akt,S6核糖体蛋白,AMPKα,PRAS40,mTOR,GSK3α,GSK3β,p70S6 激酶,Bad,RSK1,PTEN,PDK1,Erk1/2,4E-BP1)的磷酸化水平没有显著影响。8.Western blot显示0.01-1ug/ml TCS暴露24小时后可以上调IK细胞中SGK1的蛋白水平。结论:1.BPA可能是通过ER/SGK1/ENaCα通路抑制了 ENaCα的表达,从而影响小鼠子宫蜕膜化过程中的血管生成并干扰正常子宫蜕膜化过程,进而减低胚胎植入子宫内膜的成功率。2.TCS可能通过PI3K/AKT通路上调上皮细胞的SGK1蛋白,从而减低胚胎植入子宫内膜的成功率。