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转录因子结合谱是指转录因子能够特异性识别并结合的所有DNA序列及其相对亲合性，它对于研究转录因子DNA结合特异性和预测转录因子DNA靶点及靶基因都具有重要意义。目前绘制转录因子结合谱的方法可分为体内和体外两种，其中将指数富集配体进化技术(SELEX)与DNA高通量测序技术相结合产生的SELEX-Seq技术已经成为绘制转录因子DNA体外结合谱的首选方法。
核因子κB(NF-κB)是一种调控性真核转录因子，与炎症反应、细胞免疫应答和肿瘤发生等关系密切，是目前进行转录治疗和药物筛选的重要靶点。因此本论文采用基于电泳迁移率变动分析实验(EMSA)的SELEX-Seq技术绘制了NF-κBp50蛋白的高分辨率DNA结合谱，设计并论证了一套新的SELEX-Seq实验技术体系，为研究其他转录因子DNA体外结合谱提供切实可行的研究方法。
实验中首先设计并合成了三种序列:阳性序列、阴性序列和筛选序列，其中筛选序列是含有16bp随机序列的单链寡核苷酸，序列两端为PCR引物退火恒定序列。阳性序列和阴性序列的结构基本上同筛选序列，但两端带有不同于筛选序列的PCR引物退火序列;阳性序列的中间为NF-κB的一个已知结合序列（野生型序列），而阴性序列的中间为野生型序列的突变序列，与NF-κB不结合。SELEX筛选前，先将三种单链寡核苷酸序列用单引物退火、Klenow酶延伸的方法，转变为双链寡核苷酸。之后采用基于EMSA的SELEX技术筛选并富集与NF-κBp50蛋白结合的DNA分子，对富集的DNA分子再进行PCR扩增作为下一轮筛选的文库。在随机序列的每轮SELEX筛选中加入阳性序列和阴性序列，对筛选产物进行阳性序列和阴性序列的分别PCR扩增，判断筛选的特异性。经4轮SELEX筛选富集后，对各轮筛选富集的带有标签的DNA分子用近红外EMSA实验和低通量克隆测序进行分析验证。最后，将各轮筛选样品合并进行Hiseq2000高通量测序，对测序结果进行生物信息学分析，以获得转录因子NF-κBp50蛋白高分辨率DNA体外结合谱:序列频率统计获得NF-κBp50对各种DNA序列的相对结合亲合性;对各轮筛选和测序产物随机抽样，进行MEME分析，获得NF-κBp50DNA结合模体。
实验结果表明:(1)运用EMSA技术能够筛选转录因子蛋白结合序列;(2)随机抽样MEME可有效提取转录因子DNA结合模体;(3)基于EMSA的SELEX-Seq可有效地绘制转录因子DNA体外结合谱;(4)运用SELEX-Seq方法建立的转录因子结合谱可为后续DNA结合靶点及靶基因的预测和鉴定提供了重要依据。
本论文设计并论证了基于EMSA的SELEX-Seq技术绘制NF-κB高分辨率DNA体外结合谱的一套新的方法体系，本体系设计了FAM标记的阳性和阴性对照序列、新型标签序列、巢式PCR扩增、各轮产物近红外EMSA验证和克隆测序分析等技术环节，有力地保证了筛选过程的特异性和可靠性。本论文建立的一整套筛选实验体系，具有很高的通用性，可直接移植用于其他转录因子的体外结合谱绘制的研究。