【摘 要】
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龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是中国南部地区主要的亚热带经济作物水果,其果肉具有丰富的食用和药用价值。植物生长素酰胺合成酶基因（Gretchen Hagen 3,GH3）是主要的生长素早期响应基因家族之一,目前在多种植物中已证实该家族具有调节植物生长素分布稳态功能,推测龙眼GH3基因可能参与龙眼体胚发生中生长素稳态的调控过程,但目前关于DlGH3基因表达调控与功能方面的研究
【基金项目】
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国家自然科学基金（31672127,31572088）； 福建省高原学科建设经费（102/71201801101）； 福建农林大学科技创新专项基金（CXZX2020027A）； 福建省自然科学基金（2015J06004）； 福建省自然科学基金面上项目（No. 20
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龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是中国南部地区主要的亚热带经济作物水果,其果肉具有丰富的食用和药用价值。植物生长素酰胺合成酶基因（Gretchen Hagen 3,GH3）是主要的生长素早期响应基因家族之一,目前在多种植物中已证实该家族具有调节植物生长素分布稳态功能,推测龙眼GH3基因可能参与龙眼体胚发生中生长素稳态的调控过程,但目前关于DlGH3基因表达调控与功能方面的研究成果还未见报道。本研究在龙眼二代和三代测序的全基因组数据库基础上,鉴定DlGH3基因家族成员,并进行生物信息学和表达模式分析,探究DlGH3蛋白的亚细胞定位情况,验证启动子的表达活性,构建DlGH3基因过表达载体并稳定转化拟南芥,预测DlGH3基因的靶miRNA及裂解位点的验证。主要研究结果如下:1龙眼体胚发生早期GH3家族的全基因组鉴定与生物信息学分析在龙眼三代测序基因组中共鉴定10个DlGH3家族成员,其中9个成员属于亲水性稳定蛋白,DlGH3蛋白主要分布于细胞质且均存在功能上的保守性。DlGH3基因启动子中含有多种顺式作用元件,包括生长素响应元件、茉莉酸甲酯调控元件、脱落酸调控元件、赤霉素调控元件和种子特异性响应元件,值得注意的是所有DlGH3基因均存在光响应元件。2龙眼GH3家族成员的表达模式分析结合龙眼二代转录组数据库分析,发现DlGH3家族多数成员在龙眼早期SE阶段表达显著,其中DlGH3.5在龙眼EC阶段特异表达,DlGH3.3和DlGH3.11在EC与ICp EC阶段特异表达;DlGH3.11在龙眼根、茎和叶中表达最为显著;DlGH3.6在花与花芽中表达量极高;DlGH3.5在花中表达显著;DlGH3.5在白光下高表达,DlGH3.11在黑暗处理下表达量极高。利用q RT-PCR技术,探究龙眼DlGH3家族的表达模式,DlGH3.17在EC阶段表达量最高;DlGH3.1、DlGH3.9和DlGH3.17-like在GE阶段表达显著;外源生长素IAA处理下DlGH3家族除DlGH3.9和DlGH3.10基因的表达受抑制外,其他成员的表达均显著上调;2,4-D能有效引起DlGH3家族成员的表达,DlGH3家族多数成员能显著响应外源GA3,大部分DlGH3家族成员能有效响应Me JA并呈现不同响应程度,在ABA处理下,大部分DlGH3家族成员表达均上调,在SA处理下,DlGH3家族成员表达均上调。3龙眼DlGH3.5、DlGH3.6和DlGH3.11亚细胞定位和启动子功能研究构建DlGH3.5、DlGH3.6和DlGH3.11与GFP融合的亚细胞定位表达载体,利用农杆菌介导于洋葱内表皮细胞,结果表明DlGH3.5、DlGH3.6和DlGH3.11蛋白主要定位于细胞质;构建龙眼DlGH3.5、DlGH3.6和DlGH3.11启动子核心转录区域的表达载体,发现基因启动子均能促进GUS基因的高表达,DlGH3.6基因启动子能显著响应外源2,4-D的诱导,IAA、SA和2,4-D能显著诱导DlGH3.11基因启动子的转录水平。4龙眼DlGH3.5和DlGH3.6的功能研究构建龙眼DlGH3.5和DlGH3.6过表达载体,并稳定遗传转化于拟南芥中,过表达株系呈现植株矮小、抽薹少、花量少、果荚短且少和花发育不良等表型,但拟南芥过表达DlGH3.5和DlGH3.6后,种子重量增加,推测DlGH3基因与植物的胚胎发育具有重要影响。同时植株中AtPIN表达抑制,AtAUX/LAX及AtYUC表达水平普遍上调,推测DlGH3基因可能催化植株体内内源IAA合成酰胺化合物,降低了游离IAA的含量,调控下游生长素代谢通路相关基因的相对表达。5 DlGH3.5、DlGH3.6和DlGH3.11的靶miRNA预测及裂解位点验证利用在线软件psRNATarget对DlGH3基因的靶miRNA进行预测发现大量miRNA可能调控DlGH3家族成员。结果发现dlo-mi R166u可能裂解DlGH3.5,miRNA1531-5p可能裂解DlGH3.6,miRNA776可能裂解DlGH3.11,推测龙眼miRNA可能调控着DlGH3基因,进而影响龙眼早期体胚发生过程。
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