论文部分内容阅读
植物病原菌是引起植物病害的主要因素之一,给农业生产造成重大的经济损失。长期以来植物病原菌防治依赖化学农药,导致病原菌的抗药性增强、农药残留和污染环境等问题。近年来,环境友好、高效、低毒和不易产生抗药性的生物农药成为研发热点。海洋真菌由于生活在独特的海洋环境中,能够产生许多结构新颖、生物活性显著的次级代谢产物,成为了新颖结构农用活性天然产物的重要来源,其中,曲霉和木霉是海洋真菌活性化合物研究最多的属之一。本论文以海藻来源的Aspergillus sp.D40和红树来源的Trichoderma harzianum D13为研究对象,从中寻找具有抗植物病原菌活性的农药先导化合物。主要包括以下研究内容:1.目标菌株的筛选和鉴定。以烟草黑胫病(Phytophtora parasitica var.nicotianae)和烟草青枯病(Ralstonia solanacearum)为靶标,对实验室菌种库中的40株海洋真菌采用琼脂糖扩散法和菌丝生长速率法测试其提取物的抑菌效果,发现D4、D10、D12、D20、D33、D35、D38和D40共8株海洋真菌提取物对烟草黑胫病菌有抑菌效果,D12、D13、D14和D40四株海洋真菌对烟草青枯病菌有抑菌效果。结合前期的化学筛选确定目标菌株,进一步通过分子生物学和形态学鉴定,确定目标菌株D40和D13分别为曲霉(Aspergillus sp.)和哈茨木霉(T.harzianum)。2.化合物的分离和鉴定。对Aspergillus sp.D40和T.harzianum D13进行实验室规模化发酵,乙酸乙酯萃取获得其提取物。综合运用正/反向硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、半制备高效液相色谱等方法对提取物进行分离纯化,运用UV、NMR、MS、ECD等谱学方法对单体化合物进行结构鉴定。从D40中总共分离鉴定11个化合物(1–11),包括10个聚酮类化合物,1个生物碱类化合物,其中化合物asperfuranone A–C(1–3)为新化合物。有趣的是,化合物1–4和9以不可拆分的差向异构体的形式存在,并且化合物9b的相对构型是首次报道。从D13中共分离鉴定6个化合物(12–17),包括2个nafuredin类化合物,1个异香豆素类化合物,3个二肽类化合物。通过ECD计算的方法确定了新化合物nafuredin C(12)和trichodermamide G(14)的绝对构型。二肽类新化合物trichodermamide G(14)具有4,7硫桥苯并恶嗪的新颖骨架结构。3.化合物抗菌活性测定和曲霉D40发酵优化。化合物的抗菌活性测定结果表明,青霉酸(7)对烟草青枯病菌等6种植物病原细菌均具有显著的抗菌活性,IC50为11.6–58.2μg/mL。新化合物12对稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)有显著的抗菌活性,MIC达到3.13μg/mL,并对苹果腐烂病菌(Valsa mali)等3种植物病原菌具有抑制作用。化合物13对稻瘟病菌表现出了明显的抑菌活性,MIC为6.25μg/mL。由于青霉酸有一定的毒性,为继续挖掘曲霉D40抗青枯病菌的潜力,对其进行单菌株多产物策略(one strain many compounds,OSMAC)发酵优化,发现麦芽汁海水培养基发酵液提取物(BMEW)对青枯病菌有较好的抑菌活性,而菌体提取物(MMEW)却无活性。通过代谢组学分析比较两者次级代谢物的差异,BMEW中主要包括苯丙烷类化合物和小分子酚类衍生物,生物碱和初级代谢产物(核苷,糖,氨基酸,维生素和脂质)三种结构类型的109种化合物显著上调。其中苯丙烷类化合物和小分子酚类衍生物是主要的化合物,占77.06%。苯丙烷类化合物和小分子酚类衍生物被报道具有对青枯菌的抗菌活性,可能是潜在的抗菌活性物质,也为后续从该株真菌中分离鉴定抗菌化合物提供了分离依据。