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研究背景与目的邻苯二甲酸酯（Phthalates,PAEs）是在塑料制造中广泛加入的邻苯二甲酸酯的酯化衍生物。增塑剂中,邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di-（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP）是最为常用的。DEHP用于增加消费品中聚氯乙烯（Polyvinyl chloride,PVC）的弹性,如建筑材料、装修材料、医疗产品、食品容器、玩具和服装等。预计全球年度DEHP产量在2205至8818亿磅之间[1]。由于DEHP与塑料产品的弱化学结合,解离的DEHP广泛存在于环境中。含有DEHP的产品的数量和种类不同,通过口服摄入,呼吸道吸入,皮肤接触和通过医疗途径静脉内接触都可以发生暴露。DEHP及其代谢物已经在许多人体组织和液体中发现,包括尿液,血清,脐血,母乳,羊水和卵泡液。DEHP在羊水和脐带血中的存在表明它能够到达胎儿。人类接触DEHP令人担忧,因为它是已知的内分泌干扰物质和生殖毒物。研究发现,新生儿的隐睾、尿道下裂、睾丸癌,成年男性的精子质量下降、男性肛门生殖器距离（Anogenital distance,AGD）和睾酮（T）水平降低都与暴露于DEHP有关联。此外,出生前接触DEHP和子宫内膜异位症,性早熟,早期妊娠丧失,性分化异常和低出生体重具有相关性。因此,DEHP暴露于人类的健康风险引起了相当大的关注。DEHP的睾丸毒性的机制目前尚不清楚,主要包括:过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）激活途径、雌激素受体介导的机制、癌基因激活,以及通过改变负责精子成熟的酶的活性来影响精子发生等,而在这方面越来越多的可能性是诱导氧化应激。氧化应激（Oxidative Stress）是形成活性氧（ROS）与抗氧化防御机制之间的不平衡。ROS在几种重要生理功能的调节中起重要作用,但也解释了可能对细胞有害的变化,如ROS导致细胞损伤,细胞凋亡和细胞死亡。氧化应激也与生殖细胞凋亡和男性不育有关。必需的微量元素硒（Se）是细胞抗氧化防御的关键组成部分,并参与调节细胞内多种形式的细胞硒蛋白的氧化还原平衡。Se参与了从细胞抗氧化防御到DNA凋亡的保护和修复的基本生物学过程。Se对于正常精子的生产也是至关重要的,因此在繁殖中起关键作用。考虑到Se在睾丸结构和功能上的重要性以及硒摄入不足的频率和DEHP暴露的高可能性,本实验应用DEHP对46周龄雄性SD大鼠进行8周染毒试验,同时采用酵母硒进行干预,重点观察其生殖毒性,研究DEHP亚慢性染毒对大鼠的生殖毒性,并研究补硒对邻苯二甲酸酯毒性的保护作用。研究方法:将70只健康雄性SPF级SD大鼠适应性饲养3天后,按体重随机分为7组,每组10只。即对照组、3个DEHP染毒组,染毒剂量分别为300、600和900mg/kg b.wt和相应DEHP染毒剂量的3个硒干预组,即在3个DEHP染毒组饲料中分别添加1mg/kg酵母硒DEHP和酵母硒均按相应比例均匀拌入基础饲料中,制成颗粒饲料,将饲料以平均每日动物体重10%的摄食量按组别给予大鼠,连续饲喂染毒8周。染毒期间,大鼠可自由饮水、摄食。1、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠一般生长发育指标的影响:观察记录大鼠在染毒期间的一般情况（如外观、皮毛、饮水、摄食、大小便和死亡情况等）;每周记录体重、摄食、退食并计算总的食物利用率;对肝、肾、脾、睾丸、附睾进行称重,计算脏器系数,并进行统计学分析。2、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠血液生化和血细胞的影响:（1）最后一次染毒期末,大鼠禁食16 h后,称重,记录空腹体重。眼眶静脉丛取血,用3.5ml的生化血清管取大鼠全血3.5ml,应用AU640全自动生化分析仪检测总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（Cre）、碱性磷酸酶（ALP）、血清甘油三酯（TG）、血清葡萄糖（GLU）、总胆固醇（CHOL）等11个生化指标。（2）最后一次染毒期末,大鼠禁食16 h后,称重,记录空腹体重。眼眶静脉丛取血,用滴加EDTA抗凝剂的1.5mlEP管取大鼠全血1.0ml,用ADVIA2120i型全自动五分类血细胞分析仪进行血细胞自动分析。测定白细胞总数（WBC）、中性粒细胞（NEUT）、嗜酸性粒细胞（EOS）、嗜碱性粒细胞（BASO）、单核细胞（MONO）、淋巴细胞（LYM）、红细胞总数（RBC）、血红蛋白（HGB）、平均红细胞体积（MCV）、红细胞压积（HCT）、平均血红蛋白含量（MCH）、红细胞体积分布宽度（RDW）、平均血红蛋白浓度（MCHC）、直接测定的血红蛋白浓度（CMCH）、血红蛋白含量分布宽度（HDW）、血小板总数（PLT）、平均血小板体积（MPV）、血小板分布宽度（PDW）、血小板压积（PCT）和未染色的大细胞数量（LUC）及其相应百分比等指标。SPSS统计软件分析结果。3、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠精子运动能力和血清睾酮（T）的影响:（1）DEHP及硒对大鼠精子运动能力的影响研究:利用大鼠附睾尾制备精子悬液,用计算机辅助精子分析仪（Computer-aided sperm analysis,CASA）测量精子的运动参数,包括:VCL、VSL、VAP、ALH、LIN、STR、BCF、ELON等;（2）DEHP及硒对血清T的影响:最后一次染毒期末,大鼠禁食16 h后,称重,记录空腹体重。眼眶静脉丛取血,用3.5ml的生化血清管取大鼠全血3.5ml,3000r/min离心10分钟分离出血清,用放射免疫法测定血清T水平。4、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠睾丸标志酶及氧化指标的影响:将右侧睾丸组织利用超声匀浆机制备成睾丸组织匀浆液,离心取上清液-20℃冷冻保存,分别进行谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）、琥珀酸脱氢酶（SDH）以及蛋白浓度的测定。研究结果:1、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠一般生长发育指标的影响:染毒期间,300和600 mg/kg DEHP剂量组与对照组相比,均未观察到明显的异常;而900mg/kg剂量组的大鼠个别出现局部脱毛（四肢和腹部）;各染毒组的体重随染毒剂量的增加,体重略有下降,900 mg/kg剂量组与对照组相比,有明显差异（P＜0.05）。各硒干预组与相同剂量DEHP染毒组相比,体重均有所增加,Se+300mg/kg DEHP干预组与相同剂量DEHP染毒组相比,体重明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;染毒剂量增加到900mg/kg时,大鼠肝、肾、脾、睾丸、附睾的脏器系数与对照组比较均出现较大差异,且差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。2、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠血生化和血细胞指标的影响:（1）血液生化指标的影响:与肝肾相关的生化指标在DEHP染毒剂量为300和600 mg/kg剂量组时出现异常;与脂类和糖类代谢相关的生化指标中,大鼠TG和CHOL随染毒剂量的增加逐渐降低,900mg/kg DEHP染毒组与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。大鼠GLU随着染毒剂量的增加而升高,Se+600和Se+900mg/kg DEHP干预组与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.01）。（2）血液血细胞的影响:600和900mg/kg DEHP染毒组,大鼠白细胞（WBC、MONO、LUC）、红细胞（RBC、HGB、HCT、MCH、HDW）及血小板（PLT）相关指标发生异常,而硒的干预对白细胞的改变较明显,对红细胞及血小板的改变不大。3、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠精子运动能力和血清T的影响:（1）随着DEHP染毒剂量的增加,VAP、VSL、VCL、ALH、BCF及STR等多项大鼠精子运动参数指标显著降低,而在硒干预组中,则出现了明显的上升趋势。（2）随染毒剂量的增加,大鼠血清T水平逐渐降低,900 mg/kg DEHP染毒组与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）,各干预组血清T水平有所上升,Se+900mg/kg DEHP干预组与相同剂量的DEHP染毒组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。4、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠睾丸标志酶及氧化指标的影响:随着染毒剂量的增加,大鼠睾丸组织中SOD、GSH–Px酶活性逐渐降低,MDA含量逐渐增加,与对照组相比,差异均有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）,硒干预组发生了相反的变化,与相同剂量的DEHP染毒组相比,差异均有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）。SDH活性随着染毒剂量的增加先升高后降低,,LDH、ALP活性随着染毒剂量的增加逐渐降低,ACP活性随染毒剂量的增加逐渐增加,硒干预组都出现了相应的保护能力。结论:（1）通过对SD大鼠进行8周的DEHP亚慢性染毒和同时采用酵母硒进行干预,得出,雄性大鼠的肝、肾、脾、睾丸和附睾都是DEHP毒性作用的靶器官,其中肝、附睾对DEHP毒性作用最为敏感,而硒具有积极地保护作用;（2）通过对大鼠血生化和血细胞相关指标的检测,DEHP亚慢性染毒对大鼠肝肾相关生化指标和白细胞（WBC、MONO、LUC）、红细胞（RBC、HGB、HCT、MCH、HDW）及血小板（PLT）具有普遍毒性影响,硒的干预具有一定的保护作用;（3）通过对雄性大鼠精子运动能力和血清T水平的检测,随着DEHP染毒剂量的增加,VAP、VSL、VCL、ALH、BCF及STR等多项大鼠精子运动参数指标显著降低,而在硒干预组中,则出现了明显的上升趋势。随染毒剂量的增加,大鼠血清T水平逐渐降低,各干预组血清T水平有所上升,提示,DEHP扰乱了精子的运动能力,破坏雄性生殖所需的激素水平,而硒在改善DEHP诱导的有害作用方面发挥了积极地作用;（4）通过研究大鼠睾丸功能相关酶及脂质过氧化损伤作用的指标发现,随着染毒剂量的增加,大鼠睾丸组织中SOD、GSH–Px酶活性逐渐降低,MDA的含量逐渐增加,与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）,硒干预组发生了相反的变化,与相同剂量的DEHP染毒组相比,差异有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）。SDH活性随着染毒剂量的增加先升高后降低,LDH、ALP活性随着染毒剂量的增加逐渐降低,ACP活性随染毒剂量的增加逐渐增加,硒干预组都出现了相应的保护能力。提示,DEHP或其代谢产物引起脂质过氧化损伤,可能是导致睾丸组织损伤的重要机制之一,而硒通过发挥其抗氧化作用,对DEHP所致睾丸组织的氧化损伤起到了一定的保护作用,此外,DEHP还可能会通过影响这些睾丸功能相关酶的活性,造成生精细胞能量供应不足,使生精能力降低,而硒通过提高这些酶的活性可在一定程度上预防DEHP引起的睾丸毒性。