背景和目的由于疾病或创伤引起的关节软骨损伤往往会发生不可逆的病理变化，造成关节软骨退行性的改变从而诱发骨关节炎（Osteoarthritis，OA），该疾病往往伴随着疼痛而且严重时会导致残疾。由于关节软骨周围无血管存在，一旦损伤很难进行自身修复，关节软骨损伤患者往往伴随疼痛等临床症状，严重影响患者的正常生活，大大降低了生活质量。随着组织工程学技术的发展，组织工程软骨的产生为软骨损伤修复提供了一种新型的、理想的治疗手段。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs）因其来源广泛，具有多向分化能力，体外多次增殖培养不易失去原有的细胞形态和生理功能等特点被认为是目前组织工程软骨构建过程中较为理想的种子细胞来源。然而研究发现，在组织工程软骨构建中MSCs成软骨分化后期，软骨细胞去分化丧失增殖能力，形成无增殖能力的肥大化软骨细胞，失去软骨细胞的基本生理功能，不能正常分泌细胞外基质成分，最终形成纤维化软骨。因此如何使MSCs来源的软骨细胞稳定其原有的表型，构建具有长期稳定生理功能的组织工程软骨成为目前软骨组织工程研究领域亟待解决的问题。干细胞向软骨细胞分化过程是受多种生长因子和转录因子共同调节作用的，各种促进因子和抑制因子保持动态平衡从而维持关节软骨正常的代谢和生理功能。Sox9作为一种主要的转录因子在软骨形成阶段以及随后的软骨肥大化阶段都发挥了重要的调控作用，在MSCs成软骨分化过程中Sox9基因高表达，而在肥大化软骨细胞中Sox9表达降低或几乎无表达。miRNA(microRNA)是一种广泛存在于生物体内的独特的内源性小分子，大量研究证实miRNA在调节干细胞分化进程中发挥了重要的调控作用，是维持干细胞分化特性的重要调控因子。我们前期工作证实Sox9作为miR-145的靶基因在间充质干细胞成软骨分化过程中起重要调控作用。在转化生长因子-β3（TGF-β3）诱导的成软骨分化中，抑制miR-145的表达能有效促进Sox9基因的表达，从而促进MSCs向软骨细胞系的定向分化。综上我们推测，在组织工程软骨构建过程中抑制miR-145的表达，可以稳定其正常的软骨细胞表型，阻止其进入肥大分化进程，防止纤维软骨的形成从而达到软骨缺损稳定的功能性修复。这为组织工程软骨修复重建过程中，肥大化软骨细胞的形成提供了一种新的干预方法，为组织工程软骨的构建治疗软骨缺损提供了一种潜在的新治疗手段。材料与方法本实验从两个部分对抑制miR-145在MSCs成软骨分化过程中肥大化软骨细胞形成的作用效应这一假设进行验证。一、本实验利用小鼠来源C3H10T1/2细胞诱导其成软骨细胞以及肥大化软骨细胞分化。通过在软骨诱导培养基中添加转化生长因子-β3（TGF-β3）来诱导MSCs成软骨细胞分化，诱导14天后，去除TGF-β3、降低地塞米松浓度、另外加入甲状腺激素（T3）诱导后续软骨细胞肥大化分化。诱导14d、21d、28d后分别取材，通过RT-PCR检测Ⅱ胶原和Ⅹ胶原蛋白mRNA的表达情况。二、利用稳定的体外诱导小鼠来源间充质干细胞系（C3H10T1/2）成肥大化软骨细胞分化模型。将实验分为两组：实验组转染miR-145抑制剂（antagomiR-145），对照组转染antagomiR-145Control，从第10d开始进行转染，后每5d天转染一次。从诱导第14d开始取材，以后第21d、28d分别取材利用RT-PCR和免疫组织化学的方法检测抑制miR-145的表达对肥大相关基因Col Ⅹ、Ihh、PTHrP、FGFR-3、MMP-13、Runx-2mRNA表达的作用效应。结果一、MSCs细胞进行体外细胞微团培养，实验组在诱导14d后去除诱导培养基中的TGFβ3、降低地塞米松的浓度、加入适宜浓度的T3，从诱导14d开始Ⅱ胶原蛋白mRNA的表达有降低趋势，与此相反Ⅹ胶原蛋白mRNA的表达逐渐升高。由此建立了稳定的体外诱导间充质干细胞成肥大化软骨分化模型；在此基础上，利用RT-PCR技术检测肥大化过程中miR-145以及Sox9mRNA的表达变化。实验结果显示，在软骨细胞肥大分化阶段miR-145的表达量逐渐升高，而Sox9mRNA的表达逐渐减少。结合我们前期工作基础，推测抑制miR-145的表达可以延缓或阻断间充质来源软骨细胞的肥大化进程。二、对体外培养的细胞微团进行miR-145抑制剂（antagomiR-145）的转染后，RT-PCR结果表明，在肥大化阶段抑制miR-145的表达与对照组相比，可显著降低（P＜0.05）肥大化软骨细胞相关基因Col Ⅹ、Ihh、PTHrP、FGFR-3、MMP-13mRNA的表达，但是与之相反可以促进软骨细胞特异性标志蛋白Col Ⅱ的表达；与此同此，免疫组织化学染色结果也显示，抑制miR-145的表达可显著降低Col Ⅹ蛋白的表达。结论利用小鼠来源间充质干细胞通过TGF-β3及T3的联合作用，建立了稳定的体外诱导软骨细胞肥大化模型；通过Real-time PCR技术，检测出MSCs成肥大化软骨分化过程中miR-145的表达量逐渐增加，而Sox9的表达量渐渐减低，两者之间呈负相关，结合前期工作基础，推测抑制miR-145的表达可推迟软骨细胞的肥大化进程；通过细胞微团转染antagomiR-145（miR-145抑制剂），证实在T3驱动的软骨细胞肥大化过程中，miR-145表达下调可减低肥大相关基因的表达。