论文部分内容阅读
背景胃癌(gastric cancer,GC)是在世界范围常见的胃肠道恶性肿瘤之一,大约占全球肿瘤死亡率的10%,排名第二位。据估计中国的胃癌病人的五年生存率仅仅只有百分之三十六。《2015年中国癌症数据报告》表明我国每年确诊的新胃癌病人达67.9万,死亡病例达49.8万人,并且接近一半的新发胃癌病人和死亡病例都发生在中国。由于我国缺乏对早期胃癌的有效诊断方法,绝大部分胃癌患者发现病情时已经是进展期,错失了最佳治疗时间。然而早期胃癌的治愈率为85%。因此探明胃癌发生发展的分子机制,寻求新型生物标志物和有效治疗靶点具有重要的现实意义和临床意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类大小为19-22个碱基的非编码单链RNA分子。目前已有许多报道表明miRNA通过调控靶基因的表达进而参与多种细胞生物进程如细胞增殖、分化、迁移等。同时也报道了miRNAs在不同肿瘤中的异常表达,揭示了miRNAs在肿瘤发生发展中起着重要作用。miRNAs通过其5’-UTR中的“种子序列”与靶基因的3’-UTR完全或不完全结合,使靶基因的m RNA剪切降解或介导m RNA翻译抑制来负向调控靶基因的表达。多个研究团队报道了不同的miRNAs参与了GC的肿瘤化进程。同时miRNA-192和-215被报道在胃癌中表达显著上调,然而其参与GC的发生发展的分子机制还需进一步探究。Wnt信号通路是在进化上高度保守的信号转导途径,参与着胚胎早期发育、细胞分化、细胞命运决定、体轴形成等重要生物进程。Wnt/β-catenin途径为经典Wnt信号通路,其主要功能是调节基因的转录。研究表明Wnt/β-catenin信号通路与癌症的发生发展密切相关,并且Wnt/β-catenin信号通路的异常激活被发现存在于大约30%的胃癌案例中。APC(adenomatous polyposis coli)最先被发现于结肠癌中,作为知名的肿瘤抑制基因,是Wnt/β-catenin信号通路的关键负向调控因子。APC可与GSK-3β、CK1、Axin组成蛋白破坏复合体,介导β-catenin的泛素化降解,而APC的表达异常将会导致Wnt/β-catenin信号通路的激活方法利用microRNA表达谱芯片筛选在胃癌中表达上调的miRNAs,用qRT-PCR验证miRNA-192和-215在胃组织中的表达差异。利用生物信息学软件预测miRNA-192和-215的靶基因,往胃细胞中转染miRNA-192和-215的拟似物(mimic)或拮抗分子(inhibitor)后用qRT-PCR和Western blotting方法初步验证靶基因APC的表达,双荧光素酶报告实验确认miRNA-192和-215与靶基因的结合。Topflash/Fopflash荧光实验、Western blotting和免疫荧光实验验证miRNA-192和-215激活Wnt/β-catenin信号通路。Ed U检测、划痕实验和Transwell实验探究APC与miRNA-192/-215在胃癌中的细胞生物学功能。结果1.qRT-PCR检测40对配对胃癌组织及其邻近正常组织中miRNA-192和-215以及APC的表达,miRNA-192和-215在胃癌中表达显著上调(P<0.01),APC在胃癌中表达显著下调(P<0.001)。2.qRT-PCR和Western blotting及双荧光素酶报告实验确认了miRNA-192和-215直接与APC结合并负向调控其表达。3.免疫荧光定位实验证实了miRNA-192和-215促进β-catenin的入核,Topflash/Fopflash荧光实验和Western blotting验证了miRNA-192和-215通过靶向APC激活Wnt/β-catenin信号通路。4.Ed U检测、划痕实验和Transwell实验验证了APC参与调控由miRNA-192和-215诱导的细胞生物学行为。结论(1)miRNA-192和-215在胃癌中表达显著上调。(2)APC是miRNA-192和-215的靶基因。(3)miRNA-192和-215负向调控APC的表达激活Wnt/β-catenin信号通路,促进细胞增殖和细胞迁移。