乳酸杆菌S层蛋白已被证实在乳酸菌的粘附功能中起主要作用,枯草芽孢杆菌及其芽孢均对动物机体有益,但在动物肠道中停留时间短,因此通过在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示S层蛋白可增强枯草芽孢杆菌对肠道上皮细胞的粘附能力从而延长在肠道中的停留时间,最大限度地发挥枯草芽孢杆菌的益生特性。枯草芽孢杆菌芽孢表面展示载体类型包括质粒型、单交叉同源重组和双交叉同源重组。比较常用的为双交叉同源重组,常用的整合位点为淀粉酶基因位点,但这种方法存在展示效率低的缺点。本试验分别构建了三种不同方式的表面展示载体,探索三种方式的优缺点,并尝试将卷曲乳杆菌S层蛋白通过三种不同方式展示在枯草芽孢杆菌芽孢的表面。试验内容与结果如下:1.引物退火生成多克隆位点片段,构建带有Pglv启动子和多克隆位点的穿梭表达载体pLLF-2,利用该载体在枯草芽孢杆菌中成功表达了绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶,证明了穿梭表达载体构建成功并成功地表达外源蛋白。2.扩增芽孢衣壳蛋白编码基因cot B和cotZ,并在3’端引入连结肽,扩增绿色荧光蛋白基因分别与芽孢衣壳蛋白的3’端连接,通过相应的酶切位点插入穿梭表达载体pLLF-2中,构建质粒型表面展示载体pEYGJ52和pEYW27,转化枯草芽孢杆菌,获得重组菌BSYGJ52和BSYW27,诱导重组菌产生芽孢,均不能在芽孢表面观察到绿色荧光,表明质粒型表面展示载体不适用于以CotB和CotZ作锚定蛋白来展示外源蛋白。3.融合片段cot B-gfp和cotZ-gfp通过相应的酶切位点插入到单交叉整合质粒pLX-2上,得到单交叉整合载体pEYW25和pEYW26,转化枯草芽孢杆菌得到重组菌BSYW25和BSYW26,只在重组菌BSYW26的芽孢表面观察到绿色荧光,表明通过单交叉整合的方式能使CotZ作锚定蛋白来展示外源蛋白,重组菌BSYW25表面展示失败可能与芽孢衣壳蛋白在芽孢结构中的位置有关。4.在单交叉整合载体试验结果的基础上,只构建以CotZ作锚定蛋白,gfp作报告基因的双交叉整合载体,通过相应的酶切位点将融合基因cotZ-gfp插入到双交叉整合质粒pLX-2AmyE中,得到双交叉整合载体pEYW68,转化枯草芽孢杆菌,得到重组菌BSYW68,在重组菌BSYW68的芽孢表面能观察到绿色荧光,说明通过淀粉酶异位整合也能使CotZ作为锚定蛋白展示外源蛋白。5.扩增卷曲乳酸杆菌S层蛋白的编码基因sip,通过相应的酶切位点替换质粒型表面展示载体pEYGJ52和pEYW27,单交叉整合载体pEYW25和pEYW26,双交叉整合载体pEYW68中的gfp基因分别得到融合有sip基因的载体pEYW10、pEYW14、pEYW20、pEYW21和p EYW72,转化枯草芽孢杆菌得到重组菌BSYW10、BSYW14、BSYW20、BSYW21和BSYW72,诱导重组菌生成芽孢,提取芽孢外壳蛋白,Western blot检测卷曲乳酸杆菌S层蛋白,以上三种形式的表面展示方式均没有成功展示卷曲乳杆菌S层蛋白,这可能与S层蛋白本身的性质有很大关系。综上所述,本研究主要构建了质粒型表面展示载体、单交叉整合表面展示载体和双交叉整合表面展示载体,同时,尝试将卷曲乳杆菌S层蛋白通过这些载体展示在枯草芽孢杆菌芽孢的表面。初步了解了三种不同展示方式的可行性和优缺点,为实验室的下一步相关工作提供平台和依据。