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目的:通过建立MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤模型,观察并分析六味地黄丸含药血清对过氧化氢诱导下成骨细胞增殖、活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）及自噬的影响,探讨六味地黄丸治疗骨质疏松症的分子机制。方法:将SD大鼠分为空白对照组和六味地黄丸组。六味地黄丸组采用生药质量浓度为0.8kg/L的六味地黄丸水溶液,按照0.5ml/100g进行灌胃（每天上午、下午各灌胃一次）;空白对照组给予同体积的双蒸水灌胃。连续灌胃7天,于第7天首次给药2hrs后腹主动脉取血制备含药血清:静置2hrs,3000rpm离心10mins,分离血清,同组血清合并;56℃,灭活30mins,0.22μm滤膜过滤灭菌,分装,-20℃保存备用。常规培养MC3T3-E1细胞,取生长状态良好的P3-P4代成骨细胞,通过CCK-8试剂盒检测不同浓度H2O2对成骨细胞活力的影响,筛选适宜的H2O2损伤浓度及损伤时间,构建成骨细胞氧化损伤模型。检测不同浓度六味地黄丸含药血清对H2O2致细胞活力下降的干预作用,筛选六味地黄丸含药血清适宜干预浓度。将MC3T3-E1细胞分为5组:正常对照组、H2O2模型组、空白对照组、六味地黄丸组、H2O2+乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine,NAC:ROS抑制剂）组,H2DCFDA试剂盒检测细胞内ROS水平,分析六味地黄丸含药血清对H2O2致MC3T3-E1细胞ROS水平改变的影响。将MC3T3-E1细胞分为6组:正常对照组、H2O2模型组、空白对照组、六味地黄丸组、H2O2+NAC组、六味地黄丸+3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA:自噬抑制剂）组,Western blot检测各组细胞Runx 2、Beclin 1蛋白表达;q RT-PCR检测各组细胞Runx 2、Beclin 1、LC3B m RNA表达。结果:1.过氧化氢对MC3T3-E1细胞活力的影响及六味地黄丸含药血清的干预作用低浓度（0.05mmol/L）的H2O2对MC3T3-E1成骨细胞活力的抑制作用并不明显（P>0.05）,而随着H2O2浓度及作用时间的增加,细胞活力逐渐减弱。0.1mmol/L的H2O2在作用MC3T3-E1细胞24hrs后可明显抑制细胞活力（P<0.05）,接近正常对照组的60%-70%,提示MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤模型建立成功。故选择0.1mmol/L浓度的H2O2氧化损伤成骨细胞24hrs作为后续实验的展开条件。加入不同浓度六味地黄丸含药血清对MC3T3-E1成骨细胞进行保护干预后加入H2O2氧化损伤24hrs。发现相同作用时间下（24hrs）,随着六味地黄丸含药血清浓度的升高,MC3T3-E1成骨细胞活力逐渐增加,呈现一定的剂量依赖趋势。20%浓度六味地黄丸含药血清保护干预后,细胞活力为113%,与H2O2模型组相比,细胞活力明显升高（P<0.05）。5%、10%浓度的六味地黄丸含药血清保护干预下,细胞活力分别为79%、106%;而30%浓度的六味地黄丸含药血清对细胞活力具有显著抑制作用。提示20%浓度的六味地黄丸含药血清可促进H2O2作用下的MC3T3-E1细胞增殖。选择20%浓度的六味地黄丸含药血清保护干预MC3T3-E1成骨细胞24hrs为后续实验的展开条件。2.六味地黄丸含药血清对过氧化氢致MC3T3-E1细胞ROS水平改变的影响与正常对照组相比,H2O2模型组细胞ROS水平显著升高（P<0.05）;与H2O2模型组相比,六味地黄丸组细胞ROS水平明显减低（P<0.05）,与加入NAC组的细胞ROS水平比较无明显差异（P>0.05）。虽空白对照组的细胞ROS水平虽也呈降低趋势,但仍高于正常对照组和六味地黄丸组,且其与H2O2模型组相比无显著统计学差异。提示六味地黄丸含药血清可部分降低H2O2作用下MC3T3-E1成骨细胞的ROS水平。3.六味地黄丸含药血清对过氧化氢诱导MC3T3-E1细胞Runx 2、Beclin 1、LC3B表达的影响加入六味地黄丸含药血清对MC3T3-E1成骨细胞进行保护干预24hrs后加入H2O2氧化损伤24hrs。与正常对照组、H2O2模型组相比,六味地黄丸组细胞的Beclin 1蛋白表达升高（P<0.05）,而3-MA可抑制该作用;空白对照组细胞的Beclin 1蛋白表达也有增加趋势,但仍低于六味地黄丸组,且与其他组别相比较无显著统计学差异（P>0.05）。与正常对照组、H2O2模型组、H2O2+NAC组及空白对照组相比,六味地黄丸组细胞自噬相关Beclin 1、LC3B m RNA表达显著升高（P<0.05）,而3-MA可明显抑制六味地黄丸的这种作用。除六味地黄丸+3-MA组、空白对照组的Runx 2 m RNA表达低于正常对照组（P<0.05）,余各组间的Runx 2蛋白和m RNA表达无显著性差异。提示H2O2氧化损伤作用下,MC3T3-E1细胞自噬相关Beclin 1、LC3B m RNA表达降低;而六味地黄丸含药血清可提高H2O2作用下的成骨细胞Beclin 1、LC3B m RNA表达。结论:H2O2能够抑制MC3T3-E1细胞活性,使细胞内ROS水平升高,自噬相关Beclin 1、LC3B m RNA表达降低;而六味地黄丸含药血清可促进H2O2作用下的细胞增殖,降低细胞内ROS水平,提高Beclin 1、LC3B m RNA的表达。说明六味地黄丸可通过诱导自噬来减轻氧化应激状态下的MC3T3-E1成骨细胞损伤。