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EMD-621为人工合成的结构新化合物，本文首次对其体内外抗肿瘤活性进行了较为系统的研究，主要探讨了EMD-621在两种肿瘤细胞：人胃腺癌SGC-7901细胞、人宫颈癌HeLa细胞诱导细胞凋亡的机制；另外还研究了N-去甲基克拉霉素诱导HeLa细胞凋亡的机制。体内实验结果表明，EMD-621对荷S180的昆明种小鼠移植肿瘤有一定的抑制作用；体外实验结果表明，EMD-621对人宫颈癌（HeLa），人乳腺癌（MCF-7），人胃腺癌（SGC-7901），人慢性骨髓性白血病细胞（K562）均有明显的细胞毒作用。EMD-621对小鼠成纤维细胞（3T3）也有一定的细胞毒作用，但在等剂量下其毒性远低于顺铂。用形态学方法、核荧光染色、DNA片段化分析、LDH活力测定、细胞周期分布分析及Annexin V-FITC检测磷脂酰丝氨酸（PS）外翻实验充分证实了EMD-621诱导HeLa和SGC-7901细胞死亡机制为细胞凋亡。3.4μmol·L-1 EMD-621作用于HeLa细胞后，半胱氨酸天冬氨酸酶-3（cysteinyl aspirate specific proteinase-3，caspase-3）和-8的酶原被降解，caspase家族抑制剂、caspase-1、-3和-8的抑制剂可部分抑制细胞死亡，caspase-10抑制剂几乎没有作用，而caspase-9抑制剂则增加了细胞死亡率。Caspase-3底物caspase-3依赖型的DNA酶抑制物（inhibitor of caspase activated DNase，ICAD）和多聚腺苷二磷酸聚合酶（poly-（ADP-ribose）polymerase，PARP）降解，表明EMD-621诱导HeLa细胞凋亡时激活了caspase级联反应，但是caspase-9没有参与其中；死亡受体的配体FasL表达增加，推测EMD-621可能同时诱导FADD（Fas-associated protein with death domain）的表达，激活了下游的caspase途径；促凋亡蛋白Bax（Bcl-2 associated X protein）表达增加，抑凋亡蛋白Bcl-2（B-cell lymphoma-leukemia-2 gene，Bcl-2）表达降低，Bax／Bcl-2表达的比率在药物作用12h后随时间延长而升高，罗丹明123（rhodamine123）染色可见线粒体膜电位下降，表明EMD-621诱导细胞凋亡时激活以线粒体为中心的信号转导途径。细胞凋亡早期p21水平短暂升高，但此后很快被降解；药物作用12h后即可见p53表达增加，并且其表达强度逐渐增加；抗凋亡蛋白SIRT1的表达随着药物作用时间的延长而降低；p38抑制剂SB203580降低细胞的死亡率，细胞外信号调控的蛋白激酶（extracellularsignal-regulated protein kinase，ERK）抑制剂PD98059增加细胞的死亡率，c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抑制剂SP600125对细胞没有作用；ERK在12h时被抑制，p38在12h时被激活，表明p38发挥了促进细胞凋亡的作用而ERK发挥了促进细胞增殖的作用。EMD-621作用HeLa细胞24h，下调了Ser／Thr激酶Akt的表达，p-Akt先增加后降低，表明Akt参与了EMD-621诱导的HeLa凋亡。蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）家族成员在EMD-621诱导HeLa细胞凋亡过程起到促细胞增殖作用。PI3K（phosphatidylinositol 3-kinase）抑制剂wortmannin和PKC家族抑制剂staurosporine均更为显著地增加了EMD-621对ERK蛋白表达及其磷酸化的抑制。以上结果提示我们在HeLa细胞中，ERK对细胞的保护作用可能是依赖上游的PI3K和PKC途径实现的。wortmannin和staurosporine增加了EMD-621对SIRT1表达的抑制，表明SIRT1的失活可能受PI3K家族不同成员以及PKC不同亚型的调控。核内因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抑制剂PDTC和蛋白消化体（proteasome）抑制剂MG132，增加了细胞的死亡率，同时IκBα也随药物作用时间的延长而被降解，说明NF-κB可能在EMD-621诱导HeLa细胞凋亡过程中发挥作用。酪氨酸激酶在EMD-621诱导HeLa细胞凋亡过程起到促细胞增殖作用。1.6μmol·L-1 EMD-621作用于SGC-7901细胞12h后，caspase-3酶原被降解，同时ICAD和PARP降解，caspase家族抑制剂、caspase-1、-3和-10的抑制剂可部分增加细胞死亡，而caspase-8抑制剂却显著降低了SGC-7901细胞对药物的敏感性，caspase-9抑制剂几乎没有作用，表明EMD-621诱导SGC-7901细胞凋亡时caspase家族成员起到保护细胞作用。采用ORAC方法考察了EMD-621对活性氧清除的影响，结果提示EMD-621几乎无清除活性氧的能力。加入caspase家族抑制剂后，免疫印迹结果显示PARP仍被降解，进一步证明存在caspase非依赖性蛋白降解了PARP；FasL的表达先短暂增加而后减少，而FADD表达呈时间依赖性减少，推测很可能存在新的作用靶点；药物作用12h后Bax表达显著升高，Bcl-2表达显著下降，细胞色素c的释放也随着药物作用时间的延长而增加，rhodamine123染色可观察到线粒体膜电位下降，表明EMD-621通过改变Bax／Bcl-2的表达，激活以线粒体为中心的信号转导途径而诱导细胞凋亡。药物作用12h后p53表达水平升高，SIRT1表达下调，表明EMD-621能够下调SIRT1蛋白，从而促进了p53和Bax上调。p38、ERK均被激活，p38对凋亡有促进作用，ERK发挥了促进细胞增殖的作用，而JNK几乎没有发挥作用。EMD-621作用SGC-7901细胞12h，下调了Akt的表达，p-Akt也呈时间依赖性减少，表明Akt参与了EMD-621诱导的SGC-7901凋亡。NF-κB抑制剂PDTC和proteasome抑制剂MG132增加了细胞的死亡率，并且IκBα随药物作用时间的延长而被降解，说明NF-κB可能在EMD-621诱导SGC-7901细胞凋亡过程中发挥作用。PKC家族成员以及酪氨酸激酶在EMD-621诱导SGC-7901细胞凋亡过程中均起到促细胞增殖作用。本论文首次发现N-去甲基克拉霉素具有抗癌活性。60μmol·L-1 N-去甲基克拉霉素作用于HeLa细胞，形态学方法、核荧光染色、DNA片段化分析、LDH活力测定表明N-去甲基克拉霉素诱导HeLa细胞死亡机制为凋亡。实验结果表明药物作用后caspase-3酶原被降解，产生有活性的小片段caspase-3，同时ICAD和PARP降解，DNA片段化，caspase家族抑制剂，caspase-3、-9的抑制剂可部分抑制细胞死亡，表明N-去甲基克拉霉诱导HeLa细胞凋亡时激活了caspase级联反应。Bax／Bcl-2在药物作用后随时间延长而升高，抗凋亡成分Bcl-XL蛋白的表达不受影响，Cyt．c从线粒体释放到胞浆逐渐增多，表明N-去甲基克拉霉素通过增加Bax／Bcl-2的比例，降低了线粒体膜电位，激活以线粒体为中心的信号转导途径而诱导细胞凋亡。N-去甲基克拉霉素能够下调SIRT1蛋白，从而促进了p53和Bax上调。在N-去甲基克拉霉素诱导的HeLa细胞凋亡中，p38、ERK和JNK均被激活，并且三种MAPK的特异性抑制剂均对凋亡有促进作用，表明它们均发挥了促进细胞增殖的作用。N-去甲基克拉霉素作用HeLa细胞24 h，下调了Akt的表达，p-Akt先增加后开始降低，表明Akt参与了N-去甲基克拉霉素诱导的HeLa凋亡。NF-κB抑制剂PDTC和proteasome抑制剂MG132增加了细胞的死亡率，并且IκBα随药物作用时间的延长而被降解，说明NF-κB可能在N-去甲基克拉霉素诱导HeLa细胞凋亡过程中发挥作用。