分泌蛋白是一类功能非常重要的蛋白,参与了信号途径、形态发生、细胞凋亡、细胞分化、免疫防御等多种过程。分泌蛋白能够适应不同的药物运输机制,可用作治疗药物或治疗靶点。寻找新分泌蛋白并确定其生物功能有重要意义。 本研究使用各种生物信息学手段,包括 Secretome P1.0 server,Signal P,SOSUI,PSORT,Proteome Analysts subcellularlocalization server 和 BLAST,从来自人公共蛋白数据库的共35446条蛋白序列中筛选新的分泌蛋白基因。其中NSP070,NSP078,NSP092和NSP093预测为经典分泌蛋白,而NSP094,NSP095和NSP096预测为非经典分泌蛋白。本论文着重对3个新的候选分泌蛋白基因进行了初步研究,它们分别是NSP070,NSP092,及NSP096基因。 NSP070蛋白共有116个氨基酸,分子量为13302Da,定位于人12号染色体短臂12区1带(12p12.1)。运用生物信息学分析得到,1至27个氨基酸为信号肽,第58、64、73、95氨基酸为预测的丝氨酸磷酸化位点,106为苏氨酸磷酸化位点,第23位为潜在的N-糖基化位点。 通过转染COS-7细胞及Western Blot技术验证了NSP070是一个分泌蛋白。亚细胞定位分析表明NSP070蛋白定位在细胞质中,且不与高尔基体共定位,提示NSP070是一个经典分泌蛋白。再对NSP070进行布雷菲尔德菌素A(Brefeldin A,简称BFA,一种对依赖内质网/高尔基体的蛋白分泌途径的抑制剂)干扰实验发现,NSP070分泌被完全抑制,从而证明NSP070是一个经典分泌蛋白.对NSP070 mRNA水平上的组织分布考察发现它在胎盘组织中有显著表达,在肺、肝、心、胸腺中也有低水平的表达,同时免疫组化也揭示NSP070蛋白定位在胎盘细胞滋养层中,提示它可能会在人胎盘和胚胎发育阶段起重要作用。另外,为了进一步证实是否有像STRING数据库所预测的NSP070蛋白与多个蛋白存在相互作用的问题,又构建了NSP070原核表达载体转化大肠杆菌BL21,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,将制备并纯化好的谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白送到上海生物工程中心制备抗体。抗体经纯化,通过免疫沉淀技术,在人肝癌细胞SMMC-7721中发现有很多互作蛋白。表达量高的两个差异蛋白经质谱鉴定分别为肌动蛋白(actin)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)。但是,当用去除抗GST的NSP070抗体再次做免疫沉淀时发现并没有什么差异条带,因此前阶段发现的互作蛋白很可能是假阳性。用纯化并去GST的NSP070抗体在另外人肝细胞L02中做免疫沉淀发现,大约在70kDa.附近有一条差异条带,但由于蛋白含量偏低质谱鉴定未果。 NSP092蛋白共有393个氨基酸,分子量为44940Da,定位于人11号染色体短臂15区5带(11p15.5)。运用生物信息学分析得到,1至20个氨基酸为信号肽,81至384个氨基酸为Glyco-18结构域,第22、24、31、38、41、166、276、289、350位为预测的丝氨酸磷酸化位点,第20、232、242、308、324、359位为预测的苏氨酸磷酸化位点,第84、93、157位为预测的酪氨酸磷酸化位点。另外,无N-糖基化修饰位点。通过转染COS-7细胞及Western Blot表明NSP092基因并不象预测的结果那样编码了一个经典分泌蛋白,而是一个胞浆蛋白。对NSP092基因在mRNA水平上进行组织分布考察发现,它在肺、肾、肝、心、胸腺中都有表达,其中肝最高。在大多数肝癌细胞中的RT-PCR发现:NSP092基因在肝癌细胞株HepG2高表达,而在PCL,Foeus等其它肝癌细胞株未见表达。此外NSP092在人结肠癌细胞株LoVo里也未见表达。遂将NSP092基因在LoVo细胞中建立稳定株。细胞生长曲线揭示LoVo-NSP092稳定细胞株有生长抑制的现象,克隆形成实验也表明与瞬时转染空载体pcDNA3.1相比,克隆形成数明显减少,而细胞周期分析发现细胞株G1期发生阻滞(arrest)。这表明NSP092有可能是个潜在的抑癌基因。另外NSP092蛋白因为其GlycO_18结构域而被预测具有水解几丁质作用的含有几丁质酶结构域1蛋白(CHIDl)。然而将其蛋白序列与现有已知的人的几个几丁质酶蛋白序列进行比对时发现:它与其他序列的相似性很低,特别是NSP092不含有其它蛋白都具有的负责几丁质催化活性的一段蛋白序列FDGLDLDWEFPG,因此NSP092不具有水解几丁质的功能。 NSP096蛋白共有132个氨基酸,分子量为13997Da,定位于人19号染色体短臂13区3带(19p13.3).第72位为预测的丝氨酸磷酸化位点,第10、79位为预测的苏氨酸磷酸化位点。运用生物信息学分析得到:无信号肽,是一个非经典分泌蛋白。那么,通过转染COS-7细胞及Western Blot技术表明NSP096是一个分泌蛋白,且分泌不受Brefeldin A抑制,从而证实NSP096的确是一个非经典的分泌蛋白,即其分泌途径不依赖于内质网/高尔基体途径。亚细胞定位实验也证实NSP096与高尔基体不共定位。糖苷酶PNGase F的去糖基化实验也表明NSP096无N-糖基化修饰。这些都辅助说明NSP096蛋白的非经典分泌这一性质.对NSP096基因mRNA水平上组织分布的考察发现,NSP096在肝脏中有特异性表达,针对这种情况,决定考察NSP096基因在肝癌和癌旁中的表达情况。结果表明NSP096在肝癌中的表达是下调的。这也暗示了NSP096可能会在肝脏组织中发挥某种功能。另外NSP096是一个潜在的年轻基因,从现有的所有被测序公布的物种来看,只是从黑猩猩(Pan Trbglodytes)起才有,并且在进化过程中经历过纯化选择,提示NSP096的功能不可替代。