马铃薯(Solanum tuberosumL.)属于一年生茄科茄属植物。在田间生长时,马铃薯会受到各种非生物胁迫的影响。其中,温度是影响马铃薯生长和发育最重要且最不易控制的因素之一。马铃薯地上部分生长的最适温度为20～25℃,块茎形成的最适温度为15～20℃。高温对马铃薯的生长以及块茎的形成均有重要的影响,常导致马铃薯块茎产量和质量的下降。因此,研究热胁迫对马铃薯的影响机制以及马铃薯对热胁迫的响应机制,发掘耐热性相关基因,对马铃薯的育种具有重要意义。热激转录因子(Hsfs)在植物响应热胁迫的过程中发挥了重要的作用,它们通过与热激蛋白(Hsp)基因启动子区的热激元件(HSE)结合,来调控Hsp基因的表达,产生的热激蛋白进而参与到耐热调控的过程中。与动物的Hsfs相比,植物Hsfs的种类和功能具有多样性,它们除了响应热胁迫之外,还响应其它非生物胁迫。目前关于Hsfs的功能,在拟南芥、番茄、大豆、小麦等多个物种中已有研究,但在马铃薯中鲜少报道。本研究通过对高温胁迫下(35℃ day/28℃ night)和适温条件下(20℃ day/18℃ night)的马铃薯叶片进行转录组测序,鉴定马铃薯中热胁迫响应基因,在此基础上对马铃薯Hsfs家族成员的结构、表达及功能特性进行了系统的研究。主要结果如下:1.马铃薯热胁迫响应基因的转录组分析以持续3天高温处理的马铃薯叶片和正常条件下生长的马铃薯叶片为材料,提取RNA,分别构建cDNA文库,进一步对其进行RNA-seq分析。共鉴定得到1420个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),其中,771个基因显著上调表达,649个显著下调表达。利用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)对随机选出的12个差异表达基因的表达量进行检测,结果显示两种方法测得的结果具有很高的相关性,表明转录组测序结果可靠。对差异表达基因进行GO聚类分析,结果显示,这些DEGs被聚类到49个不同的GO类型中,其中,生物学过程(biological process,BP)27个,分子功能(molecular function,MF)16个,细胞组分(cellular component,CC)6个。在生物学功能这一类别中,涉及基因数目最多的GO功能类型是“响应外界刺激(response to stimulus)”,包含了127个DEGs;在分子功能类别中,“催化活性(catalytic activity)”是主要的功能主体,涉及到310个DEGs,是49个功能主体中包含DEGs最多的类型;在细胞组分类别中,“质体(plastid)”是主要的基因功能主体,包含了 55个DEGs。这一分类结果显示了热胁迫响应基因功能的多样性。为了进一步研究差异表达基因可能参与的生物学途径,将它们的基因序列比对到KEGG数据库中,发现这些DEGs可被富集到110个代谢途径中。根据富集的显著性,筛选出了最显著的19个途径,包括“柠檬烯与蒎烯降解途径”(ko00903)、“淀粉蔗糖代谢途径”(ko00500)、“植物病原体防御反应”(ko04626)和“植物激素信受热胁迫影响。利用构建的差异基因表达谱,对Hsfs和Hsps的表达情况进行分析,结果发现,持续热胁迫3 d后,大多数Hsfs的表达没有显著性差异,HsfA2和HsfA3显著下调表达。与Hsfs不同,尽管大多数Hsps成员的表达量在长期热胁迫后也没有显著差异或是表达量显著下调,但仍有一些Hsps成员号转导途径”(ko04075)等。这一结果表明这些生物学途径可能参与耐热性调控或在热处理3天后高表达,如Hsp26-CP和Hsp70,尤其是Hsp26-CP,其在热处理组中的表达量是对照组中的433倍。2.马铃薯Hsfs家族成员的全基因组鉴定以及功能分析尽管前面的转录组测序结果显示马铃薯Hsfs在长期热胁迫下不能高效表达,但是,我们的预试验表明,短期热胁迫能诱导一些Hsfs表达,提示这些Hsfs可能参与了早期马铃薯热胁迫响应过程。利用马铃薯基因组资源数据库、NCBI数据库以及植物转录因子数据库,经过BLASTp同源搜索,去除重复的序列和不含完整DNA结合域(DBD)的保守序列,共鉴定得到27个马铃薯Hsfs家族成员。其氨基酸序列长度从201个氨基酸残基(StHsf026)到501个残基(StHsf005)不等,理论等电点变化范围是4.71(StHsf014)到9.58(StHsf026),这些结果预示了其结构和功能的多样性。根据HR-A和HR-B结构域之间氨基酸残基的数目不同,将27个StHsfs分成A、B、C三大类,并根据其它植物的分类法则,将马铃薯Hsfs细分为不同的亚家族。Hsfs基因不均匀地分布在除了 1号和5号马铃薯染色体外的其它10条染色体上。其内含子-外显子结构图表明,马铃薯Hsfs成员内含子的位置、数目和长度均存在一定程度的差异性。通过MEME保守基序检测软件,预测出StHsf蛋白中的20个保守模块,揭示了这些蛋白质在结构和功能上的保守性和多样性。通过马铃薯基因组数据库下载得到的RNAseq数据(PGSC,2011),对马铃薯27个Hsfs在不同组织中的表达情况进行了分析,发现大多数StHsfs基因在马铃薯多个组织中表达,表明这些基因参与了不同的马铃薯生物学过程;而少数基因的表达具有组织特异性,例如StHsf015(StHsfA8b)和StHsf017(StHsf48d)只在块茎中高效表达,表明它们可能参与了块茎的形成和发育。利用qRT-PCR的方法,对其中的18个StHsfs在短期(0h,2 h,6h和24h)热胁迫、干旱胁迫和冷胁迫下的表达情况进行了分析,结果表明,18个StHsfs成员对这三种胁迫均有不同程度的响应:在热胁迫下,15个StHsfs上调表达,3个下调表达;在干旱胁迫下,3个StHsfs受干旱胁迫诱导上调表达,15个下调表达;在冷胁迫下,5个上调表达,13个StHsfs下调表达。其中StHsf004、StHsf005和Stsf009受高温诱导表达水平比其它成员高;StHsf007、StHsf009和StHsf014受冷胁迫诱导表达水平高于其它成员。为了深入研究StHsfs及其相关基因之间潜在的调控关系,利用已公布的马铃薯中40多个样本的转录组测序数据(PGSC,2011),通过WGCNA方法构建了StHsfs的共表达网络,并得到15个共表达模块。其中,模块1中包含了 StHsf005(StHsfA3)和与之表达相关的642个基因,是这15个模块中最大的模块,包含的基因数目最多。通过分析这些相关基因的注释信息,发现在持续热胁迫3天后能够高效表达的Hsp26-CP和Hsp 70基因与StHsfA3在同一个模块中,说明Hsp26-CP和Hsp70可能是StHsfA3的共表达基因,它们的表达可能受HsfA3的调控。这些结果为进一步研究StHsfs的功能机制提供了基础。3.StHsfA3过表达转基因马铃薯植株的耐热性鉴定及StHsfA3与相关StHsps的表达调控关系初步研究在前面的研究中我们发现StHsfA3在短期热胁迫诱导下高效表达,预示着StHsfA3可能在提高植株耐热性方面起作用;StHsfA3与StHsp26-CP和Stsp 70处于同一个共表达模块中,说明StHsp26-CP和StHsp 70的表达可能会受到StHsfA3的调控。为了研究StHsfA3在提高植物耐热方面的作用以及StHsfA3与相关Hsps之间的调控关系,我们克隆并分析了马铃薯HsfA3的cDNA序列,得到长度为1506 bp的StHsfA3基因片段。该基因编码501个氨基酸,相对分子量为55.23 kDa,理论等电点为4.9。进而构建StHsfA3-pBA002过表达载体,转化马铃薯植株,通过PCR和qRT-PCR检测,共鉴定得到5个独立的StHsfA3过表达转基因马铃薯株系。对转基因植株和非转基因植株叶片中的相对含水量(RWC)以及丙二醛(MDA)含量进行了测定,结果表明,在热胁迫下转基因植株叶片中的相对含水量显著高于非转基因植株,MDA含量显著低于非转基因植株,说明StHsfA3基因在马铃薯耐热过程中起到正调控作用。对StHsfA3、StHsp26-CP和StHsp 70在不同马铃薯植株中的表达水平进行qRT-PCR分析,结果显示,在正常温度条件下,StHsp26-CP和Stsp 70在StHsfA3过表达转基因植株中的表达水平显著高于非转基因植株,表明StHsp25-CP和StHsp70的表达可能受到HsfA3的诱导,它们之间的互作关系有待进一步研究。