论文部分内容阅读
脂肪酶是能在油水界面上水解甘油三酯的一类酶的总称,主要来源于动物、植物和微生物。许多利用脂肪酶的工业催化过程都要求较高的反应温度,因此对脂肪酶的热稳定性以及最适温度提出更加苛刻的要求。从温度较高的环境中筛选耐高温的脂肪酶是一个有效的途径。本课题从小笼包蒸屉垫中筛选得到了高产耐高温脂肪酶菌株S3,对其进行了菌种鉴定、脂肪酶发酵优化和脂肪酶纯化以及酶学性质研究。以产脂肪酶作为筛选标准从小笼包蒸屉垫中筛选得到了高产脂肪酶菌株S3和S4,并对其进行了耐温特性的研究。菌株S3和S4发酵上清液中的脂肪酶酶活分别为10.61U/mL和14.43U/mL。菌株S3脂肪酶的最适反应温度为50℃,并且酶液在50℃保温5h没有酶活损失；另一株菌S4脂肪酶的最适反应温度为60℃,酶液在50℃保温5h后酶活剩42.19%,在40℃保温5h没有酶活损失。由于S3发酵液比较稀,S4发酵液比较粘稠,考虑到后续进行的分离纯化等一系列研究,以及S3脂肪酶相对较好的耐热性,选择菌株S3作为目标菌株。通过形态观察、26S rDNADl/D2区域鉴定和ITS序列鉴定对菌株S3进行了菌种鉴定,依据26S rDNA鉴定结果,菌株S3是Aureobasidium pullulans HN2.3;依据ITS序列鉴定结果,菌株S3是Aureobasidium pullulans HK58-3(1)。以此可以确定得到的菌株S3属于Aureobasidium pullulans。通过单因素实验逐个对发酵过程中摇瓶的发酵条件、发酵培养基成分进行了优化。确定了最佳发酵培养基成分(w/v)为：酵母提取物2%,胰蛋白胨2%,葡萄糖1%,麦芽糖1%,吐温200.15%,玉米油4.5%；最佳发酵条件：接种量1.5%,装液量30mL(250mL锥形瓶)；最佳产酶时间：30℃、200r/min发酵96h收集粗酶液。通过优化,脂肪酶产量提高到18.28U/mL,是同批次原培养基发酵酶产量的2.16倍。经过离心、过滤、超滤和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析等步骤,得到的纯化脂肪酶在SDS-PAGE电泳检测中显示了一条分子量为39.5kDa的清晰条带。纯化后的比酶活为17.74U/mg pro,纯化倍数为18.16倍,脂肪酶活力回收率为7.26%。纯化后脂肪酶的最适反应条件为40℃和pH7.0,并且能在10-40℃和碱性pH范围(pH7.0-10.0)保持稳定。脂肪酶对30%的正己烷、正丙醇、异丙醇和DMSO、10mM K+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Fe2+离子溶液、Triton X-100、 SDS、EDTA和DTT溶液有一定的耐受性。脂肪酶还可以在高NaCl浓度(1M)条件下保持酶活的稳定。Tween20和Tween80可以有效地提高脂肪酶的酶活。