精子尾部是由位于曲精细管上皮的精原干细胞经历有丝分裂、减数分裂后,在精子变态过程中形成。尾部是精子的代谢与运动器官,与精子的活动能力有密切关系,而精子的活动能力是完成受精的重要前提条件。当精子的活力低下、尾部畸形或行动方向不规则都可能导致不育。研究精子尾部形成的分子机理对于探寻精子形成及精子结构异常造成的精液品质不良的成因具有重要意义。目前的研究还无法还原精子尾部的体外生成过程。本研究选择在精子尾部起重要作用的基因Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr,通过克隆获得完整CDS序列,对其序列特征、时空表达规律、表达产物的亚细胞定位进行分析研究,并探索基因的过表达对体外培养精原干细胞分化的影响,从而为深入研究精子尾部发生的分子机理及调控机制奠定基础。全文结果如下：一、采用RT-PCR和RACE的方法克隆了猪Odf2、Odf3、Tektin4基因及Cabyr基因的3种剪接体cDNA序列；对所获序列利用软件分析编码氨基酸的结构、同源性比较及分子进化树的构建。结果表明Odf2基因cDNA长3300bp,编码蛋白长度为810个氨基酸,有连续的Coiled coil结构；Odf3基因cDNA长1154bp,编码蛋白长度为193个氨基酸,序列中含有5个保守的PGP位点,经过序列多重比对,PGP位点在人类、犬、牛、小鼠和大鼠氨基酸序列中所处位置具有较高的同源性与保守性。Tektin4基因cDNA序列长1500bp,编码蛋白长度为447个氨基酸。具有TEKTIN家族保守结构域,即4个Colled coil结构,在螺旋Helix2A和Helix2B之间存在TEKTIN家族特征的信号序列RPNVELCRD。Cabyr基因在梅山猪睾丸中出现3种剪接体,其中Cabyrl和Cabyr2编码蛋白长度为433个氨基酸,Cabyr3编码蛋白长度为382个氨基酸,在两个蛋白的N端存在RⅡa功能域。利用ClustalW分析猪Odf2、Odf3、Tektin4及Cabyr基因编码氨基酸与其它物种的同源性发现4个基因中Odf2和Odf3氨基酸序列与其他哺乳动物同源性较高,达84-97%。Tektin4为78-89%。Cabyrl编码氨基酸的同源性最低,为58-78%。利用DNAMAN构建的分子进化树符合生物学分类。二、利用半定量PCR的方法检测150日龄梅山公母猪组织器官中Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因的表达特征。结果表明Odf2和Odf3基因为睾丸特异性表达基因。Tektin4在公猪的睾丸、垂体、母猪的子宫角和输卵管中有表达,其中在睾丸中表达丰度较高。Cabyr基因在所检测的组织中均可见表达。利用荧光定量PCR的方法分析以上基因在2、30、60、90、150日龄段梅山公猪睾丸中的表达规律。结果表明Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因在2日龄和30日龄的猪睾丸中不表达,从60日龄开始表达。此时附睾尾出现少量精子,说明Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因的表达与公猪的精子发生时间一致。Odf2和Odf3基因在90日龄和150日龄的表达量显著高于60日龄的表达(P<0.01),90日龄和150日龄之间的表达量差异不显著(P>0.05)。Tektin4和Cabyr基因150日龄的表达量极显著高于60日龄和90日龄(P<0.01),60日龄和90日龄之间的表达量差异不显著(P>0.05)。60-90日龄间梅山公猪初情期启动,开始产生完整形态的精子,推测Odf2和Odf3基因在90日龄的高表达与初情期启动过程有关。三、利用融合报告基因定位法和间接免疫荧光法研究Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因编码氨基酸的亚细胞定位。将构建成功的pEGFP-C1-Odf2、pEGFP-C1-Odf3、 pEGFP-C1-Tektin4和pEGFP-C1-Cabyr的质粒分别转染NIH-3T3细胞,24小时后在荧光倒置显微镜下观察。结果显示Odf2、Odf3和Cabyr融合蛋白定位于细胞质和细胞核,Tektin4融合蛋白定位于细胞核。将构建成功的pcDNA3.1-Odf2,pcDNA3.1-Odf3, pcDNA3.1-Tektin4, pcDNA3.1-Cabyr重组表达载体转化DH5α,纯化质粒并免疫小鼠,分离鼠抗猪的多克隆抗血清。pcDNA3.1-Tektin4, pcDNA3.1-Cabyr, pcDNA3.1-Odf2, pcDNA3.1-Odf3重组表达载体转染NIH-3T3细胞24小时后,将多克隆抗血清分别稀释1：50、1：100、1：200、1：300,采用间接免疫荧光法观察Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因编码氨基酸的亚细胞定位。结果发现四个基因编码氨基酸均定位于细胞质,与生物信息学预测的结果一致。自制的多抗血清能够识别目的蛋白,抗体效价在1：50最好。四、利用半定量PCR研究Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因在成熟精子RNA中的表达,结果发现仅Cabyr基因在精子中呈低丰度表达,Odf2、Odf3、Tektin4在精子中不表达。利用自制的多抗血清,采用间接免疫荧光法研究Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr蛋白在成熟精子中的定位。结果表明Odf2定位于精子头部的顶体和赤道区、颈部、尾部主段与中段。Odf3定位于精子的尾部主段和中段。Tektin4定位于精子头部的顶体与赤道、尾部的主段和中段。Cabyr在整个精子表面均可见荧光。说明Odf3蛋白参与精子尾部的形成。Odf2和Tektin4除了参与精子尾部的形成,可能还有其他的功能。Cabyr可能与参与精子的能量供应和精子获能有关。五、采用差速贴壁法培养猪精原干细胞并鉴定。结果表明初生仔猪睾丸分离培养的细胞符合精原干细胞的形态特征,传至第三代的细胞AKP染色为阳性,且表达精原干细胞特异性基因Oct4和CD9,说明所获得的细胞为精原干细胞。六、利用半定量PCR研究过表达Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因对猪精原干细胞体外精子发生过程相关基因表达的影响。将pEGFP-C1-f2、pEGFP-C1-Odf3、 pEGFP-C1-Tektin4和pEGFP-C1-Cabyr重组质粒分别转染猪精原干细胞,另有一组同时转染4个质粒于猪精原干细胞。48小时后细胞可检测到目的基因mRNA的表达,同时转染4个质粒的细胞可以检测到4个基因同时表达。EGFP-C1-Odf2转染猪精原干细胞后可检测到减数分裂特异性表达基因Sycp3,说明Odf2基因的过表达可能会启动猪精原干细胞减数分裂的发生。同时转染4个质粒的细胞可检测到减数分裂另一特异性表达的基因Dmcl,说明可能有基因协同启动减数分裂的发生。七、利用荧光定量PCR研究RA诱导与过表达Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因对于小鼠精原干细胞(mSSCs)体外精子发生相关基因表达的影响。10-5M和10-6M的RA培养鼠精原干细胞10天后,收集细胞采用荧光定量PCR的方法检测精子发生过程相关基因的表达,结果表明RA浓度为10-5M时Dazl基因的表达量显著降低(P<0.05),Sycp3基因的表达显著上升(P<0.05),说明10-5M的RA可以使mSSCs启动减数分裂。将10-5M的RA诱导细胞10天后转染pcDNA3.1-Odf2,pcDNA3.1-Odf3,pcDNA3.1-Tektin4,pcDNA3.1-Cabyr,48小时后收集细胞,提取RNA并反转录,利用荧光定量PCR的方法检测精子发生过程相关基因的表达。结果表明经RA诱导后过表达Odf2使得Dazl基因的表达量显著降低(P<0.01),10-5M的RA诱导后过表达Odf3使得Dazl基因的表达量显著降低(P<0.05),Sycp3基因的表达量进一步上升,但组间无差异。无TP2和Prm1基因的表达,说明没有使mSSCs完成减数分裂。但RA诱导后过表达Odf2组的细胞出现类似精子尾部的突起,结合Dazl和Sycp3基因的表达说明可能精原干细胞向精子发生的方向进一步分化。