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背景术后肠梗阻(Postoperative ileus,POI)是外科腹部手术后最常出现的并发症之一,其典型表现为肠动力障碍,且多伴有炎症细胞浸润。由γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA)、谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)等元件构成的GABA系统也存在于肠道,可通过胆碱能系统影响肠动力。免疫细胞也能合成和分泌GABA,故我们推测POI时增生的免疫细胞可通过GABA系统影响肠动力。免疫细胞内的脂褐素等脂质成分会产生大量自发荧光(Autofluorescence,AF),严重干扰对免疫荧光(Immunofluorescence,IF)目的信号的获取和实验结果的判断,苏丹黑B(Sudan black B,SBB)可通过结合脂质形成棕黑色颗粒从而吸收AF,大鼠肠道内有丰富的免疫细胞,但大鼠肠道内AF的表达情况以及SBB是否能降低大鼠肠道内的AF尚不清楚。目的观察正常大鼠空肠、回肠、结肠中的GAD表达与分布;检测POI模型大鼠肠道肌层内GABA和GABA受体表达的变化;检测POI模型大鼠肌层肠道免疫细胞变化与种类,以及肌间神经节胆碱能系统的改变;探讨免疫细胞和GABA系统在POI肠动力障碍中的作用;观察大鼠肠道冰冻切片组织内AF的表达情况,并探讨SBB降低大鼠肠道AF的最佳条件,从而获得优化的特异性IF信号以便更准确的反映大鼠肠道内抗原的实际表达。方法1.动物模型制备:采用成年健康雄性SD大鼠,10%水合氯醛麻醉,将小肠牵出用湿棉球上下擦拭五到六次后还纳回腹腔。2.取材:术后24 h后取材,部分新鲜组织用于Western blot,部分用4%多聚甲醛固定,梯度蔗糖脱水后做冰冻切片用于形态学检测。3.利用肠推进运动实验评估肠动力,利用HE染色观察POI大鼠的肠道形态并进行肠道黏膜损伤Chiu’s病理评分。4.利用免疫组织化学和免疫荧光技术检测正常大鼠空肠、回肠和结肠内GAD、GABA受体的表达和分布。5.利用免疫组织化学和免疫荧光技术检测POI组与假手术组(Sham)大鼠空肠、回肠和结肠内GAD、GABA B受体(GABA_B)、乙酰胆碱转移酶(Choline acetyltransferase,ChAT)的表达与改变。6.利用Western blot技术检测POI与Sham组大鼠肠道内GABA_B受体表达的变化。7.观察正常SD大鼠肠道内的AF,测试肠道SBB染色的适宜浓度和时间,并观察SBB染色应用于IF染色后对肠道AF的影响。结果1.正常大鼠空肠和回肠黏膜和肌层中均表达有GAD。2.POI大鼠模型造模成功。3.POI大鼠小肠肌层的GAD表达增加,且GAD阳性细胞多同时表达CD45及CD68。4.POI大鼠小肠肌层GABA_B受体表达上调,肌间神经节内ChAT表达降低。5.大鼠肠道内存在大量AF,且不受血清封闭影响;0.3%SBB染色10 min可显著降低大鼠肠道AF,提高IF染色特异性。结论正常大鼠肠道黏膜与肌层均分布有GAD阳性细胞。POI时大量免疫细胞在肌层浸润,这些细胞可能通过合成GABA并激活肌间神经节内胆碱能神经元上表达的GABA_B受体,通过其抑制作用降低胆碱能神经元活性,最终降低维持平滑肌收缩的胆碱能信号,抑制肠动力。本研究为POI肠动力障碍提出了可能的新机制,GABA_B受体抑制剂可能成为缓解和治疗POI的新靶点。此外,大鼠各肠段均大量存在明显的AF;0.3%SBB染色10 min可显著降低大鼠肠道内的AF,同时对目的荧光无显著影响。