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研究背景心力衰竭作为各种心脏疾病的严重表现和晚期阶段,发病率不断增加,发达国家心衰发病率为1%~2%,70岁以上为10%;在我国≥35岁的成年人中,心衰的患病率为1.3%,约为1370万人。运动耐量下降是心衰患者的典型特征,严重影响患者的生活质量和预后。在慢性心力衰竭的晚期,通常会观察到骨骼肌质量的减少(肌少症)。校正心功能后,骨骼肌消耗仍是心衰患者运动耐量下降的独立预测因素。研究表明,心衰患者肌少症发病率较健康人群提高20%,心衰合并肌少症患者较单纯心衰患者运动耐量下降更加严重。肌少症作为心衰的一种常见合并症,降低了患者运动耐量,增加了再住院率及死亡率,为预后不良的重要标志。然而心力衰竭状态下,肌少症发生和发展机制不明,缺少以机制为基础的靶向治疗。建立贴合临床实际的动物模型是疾病研究的基础,才能真正为临床诊治提供切实有力的证据。但是迄今为止尚缺乏心力衰竭合并肌少症的动物模型。肌肉是高耗能器官,线粒体是骨骼肌调节能量代谢的重要细胞器。线粒体通过调整其体积、结构和功能来应对疾病和衰老。线粒体功能障碍通常可导致细胞凋亡的发生,但是骨骼肌细胞的多核性质,使骨骼肌细胞凋亡导致的是肌纤维萎缩而不是全细胞死亡,并且肌细胞凋亡在骨骼肌蛋白质分解代谢之前发生,表明肌细胞凋亡可能是骨骼肌萎缩的启动因素。线粒体自噬是高度选择性的自噬,受损或者多余的线粒体通过自噬溶酶体系统降解实现线粒体质量控制,以此保护细胞免受线粒体损伤造成的有害影响。线粒体自噬减弱后,受损的线粒体在细胞内囤积,产生大量的ROS,激活泛素-蛋白酶体系统。但是迄今为止,线粒体相关骨骼肌细胞凋亡和线粒体自噬是否为心力衰竭状态下肌少症发生的机制尚不清楚。为了有效改善心力衰竭患者运动耐量降低,减少肌少症发生,本研究从药物和基因水平进行了相关探索。在心力衰竭治疗药物中,左西孟旦被证实有线粒体保护作用,一系列实验和临床研究发现左西孟旦可激活心肌细胞线粒体ATP敏感钾通道(mito-K+ATP channels),与心脏保护、梗死面积缩小和减轻缺血/再灌注损伤有关,但是左西孟旦是否可通过mito-K+ATP激活机制改善骨骼肌萎缩尚不清楚。TRIB3是一种假激酶,研究表明TRIB3敲除可促进衰老小鼠骨骼肌自噬,改善衰老小鼠骨骼肌萎缩。但是TRIB3是否参与线粒体自噬从而影响骨骼肌萎缩尚未明了。本研究拟在动物和细胞水平探讨线粒体相关骨骼肌细胞凋亡、线粒体自噬在缺血性心力衰竭合并肌少症中的作用及左西孟旦干预效果。研究目的(1)探讨左前降支结扎联合后肢制动建立缺血性心力衰竭合并肌少症小鼠动物模型的可行性;(2)研究线粒体相关骨骼肌细胞凋亡在缺血性心力衰竭合并肌少症发病中的作用;(3)探讨左西孟旦对缺血性心力衰竭合并肌少症的干预作用及其机制;(4)研究TRIB3介导的骨骼肌线粒体自噬在缺血性心力衰竭合并肌少症发病中的作用及其机制。研究方法(1)实验动物分组:10~12周龄雄性C57BL/6小鼠,分为对照组、假手术组、左前降支结扎组、左前降支结扎+后肢制动组;10~12周龄雄性C57BL/6小鼠,分为对照组、心力衰竭组、心力衰竭+溶剂组、心力衰竭+左西孟旦组、心力衰竭+肌少症组、心力衰竭+肌少症+溶剂组、心力衰竭+肌少症+左西孟旦组;10~12周龄雄性C57BL/6小鼠与TRIB3-/-小鼠,各分为对照组、缺血性心力衰竭合并肌少症组;(2)体外实验分组:培养C2C12细胞,分为对照组、地塞米松组、地塞米松+左西孟旦组、地塞米松+左西孟旦+5-羟基癸酸钠(5-HD)组、地塞米松+5-HD组;培养并分化C2C12细胞,分为对照组、TRIB3沉默组、TRIB3过表达组、地塞米松组、地塞米松+TRIB3沉默组、地塞米松+TRIB3过表达组;培养并分化C2C12细胞,分为对照组、TRIB3沉默组、地塞米松组、地塞米松+TRIB3沉默组、地塞米松+TRIB3沉默+EX527组;(3)采用超声心动图检测小鼠心脏结构和心功能的变化;(4)采用前肢拉力、笼线实验、跑步机疲劳实验检测小鼠运动能力;(5)采用血清学检测小鼠心衰和肌肉损伤指标;(6)采用病理组织学染色检测检测骨骼肌的形态、肌纤维分型、炎症指标表达水平和凋亡水平的变化;(7)采用分子生物学检测组织和细胞氧化应激、线粒体功能、凋亡水平、线粒体自噬水平的变化。研究结果(1)与假手术组小鼠相比,左前降支结扎+后肢制动组小鼠LVEF及LVFS明显下降,表明前降支结扎+后肢制动组小鼠心功能下降;与假手术组小鼠相比,左前降支结扎+后肢制动组小鼠前肢抓握力、悬挂冲量下降,最长运动时间减少,最长运动距离缩短,表明左前降支结扎+后肢制动组小鼠运动能力下降;与假手术组小鼠相比,左前降支结扎+后肢制动组小鼠血清LDH、CK水平升高,腓肠肌/胫骨长度下降,肌纤维横截面积减小,说明前降支结扎+后肢制动组小鼠骨骼肌损伤、肌纤维萎缩;与假手术组小鼠相比,左前降支结扎+后肢制动组小鼠慢肌纤维比例下降、快肌纤维比例上升、慢肌纤维/快肌纤维下降,表明左前降支结扎联合后肢制动小鼠发生肌纤维类型转换;(2)与对照组小鼠相比,心力衰竭+肌少症组小鼠LVEF及LVFS明显下降,前肢抓握力、悬挂冲量降低,最长运动时间缩短,最长运动距离减少,骨骼肌线粒体含量及膜电位下降,腓肠肌/胫骨长度、肌纤维横截面积下降,慢肌纤维比例降低、快肌纤维比例升高、慢肌纤维/快肌纤维降低,凋亡水平上升、氧化应激及炎症水平上升;与心力衰竭+肌少症组小鼠相比,心力衰竭+肌少症+左西孟旦组小鼠LVEF及LVFS明显上升,前肢抓握力、悬挂冲量增加,最长运动时间延长,最长运动距离增加,骨骼肌线粒体含量及膜电位上升,腓肠肌/胫骨长度、肌纤维横截面积增加,慢肌纤维比例增加、快肌纤维比例下降、慢肌纤维/快肌纤维增加,凋亡水平下降、氧化应激及炎症水平下降;(3)与对照组相比,地塞米松组肌细胞萎缩指标表达升高、线粒体含量及膜电位下降、氧化应激及凋亡水平升高;与地塞米松组相比,地塞米松+左西孟旦组肌细胞萎缩指标表达下降、线粒体含量及膜电位升高、氧化应激及凋亡水平下降;与地塞米松+左西孟旦组相比,地塞米松+左西孟旦+5-HD组肌细胞萎缩指标表达升高、线粒体含量及膜电位下降、氧化应激及凋亡水平升高;(4)与心力衰竭合并肌少症组小鼠相比,TRIB3-/-+心力衰竭合并肌少症组小鼠LVEF及LVFS差异无统计学意义,前肢抓握力、悬挂冲量增加,最长运动时间延长,最长运动距离增加,腓肠肌/胫骨长度差异无统计学意义,肌纤维横截面积增加,慢肌纤维比例增加、快肌纤维比例下降、慢肌纤维/快肌纤维增加,骨骼肌线粒体含量及膜电位上升,氧化应激水平下降,线粒体自噬水平上升,Sirt1/Mfn2信号传导通路上调;(5)与地塞米松组相比,地塞米松+TRIB3沉默组肌细胞萎缩指标表达下降、线粒体含量及膜电位升高、氧化应激水平下降、线粒体自噬水平升高、Sirt1/Mfn2信号传导通路上调;与地塞米松+TRIB3沉默组相比,地塞米松+TRIB3沉默+EX527组肌细胞萎缩指标表达升高、线粒体含量及膜电位下降、氧化应激水平升高、线粒体自噬水平下降、Sirt1/Mfn2信号传导通路下调。研究结论(1)本研究采用冠状动脉左前降支结扎联合后肢制动的方法,建立了心力衰竭合并肌少症的动物模型;(2)缺血性心力衰竭合并肌少症小鼠骨骼肌线粒体功能障碍,进一步导致肌细胞凋亡增加,骨骼肌萎缩,运动能力下降;(3)左西孟旦通过激活mito-K+ATP通道,可改善线粒体功能,减轻肌细胞凋亡,改善肌细胞萎缩,为左西孟旦治疗缺血性心力衰竭合并肌少症提供了实验依据;(4)TRIB3敲除可改善缺血性心力衰竭合并肌少症小鼠骨骼肌线粒体功能障碍,促进线粒体自噬,改善骨骼肌萎缩,进而提高运动能力;(5)TRIB3沉默通过上调Sirt1/Mfn2信号传导通路,改善肌细胞线粒体功能,减轻氧化应激水平,促进线粒体自噬,改善肌细胞萎缩。