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维生素E又称生育酚,是仅由光合生物合成的一类脂溶性的强抗氧化剂,为人体所必需的维生素之一,它可以清除生物体内的活性氧和自由基。因此,食用维生素E可以增强机体免疫功能,具有防衰老、防癌、减缓多种恶性疾病(白内障、神经紊乱、心血管疾病等)及润肤美容的作用。但是,在植物当中生育酚的含量又普遍较低,因此,采用基因工程技术手段提高植物当中的生育酚的含量成为目前营养基因组学研究的热点。
大豆尿黑酸叶绿醇转移酶处于维生素E生物合成途径的关键一步,它的作用是催化叶绿醇焦磷酸(phytyl-PP)与尿黑酸(HGA)缩合生成生育酚的前体。随着维生素E代谢途径的阐明以及相关基因的克隆,人们开始通过分子生物学技术研究如何提高植物中α-生育酚的含量。为探索利用基因工程手段提高总生育酚含量,本研究采用RT-PCR技术,从大豆中分离了尿黑酸叶绿醇转移酶的全长cDNA序列,该cDNA序列全长1200bp。为了进一步研究该基因的功能,本文得到了以下结果:
1.提取大豆总RNA,利用RT-PCR技术,从大豆中分离了大豆尿黑酸叶绿醇转移酶(HPT)的全长cDNA序列。
2.构建了大豆基因的植物表达载体pBI121-HPT,通过真空渗透法转化拟南芥,获得转基因植株35株,PCR检测阳性率是51.2%。通过自交和抗性筛选标记获得了转基因纯系植株。
3.利用HPLC测定转基因植株的总生育酚含量,结果显示,转基因植株的总生育酚含量普遍高于野生型植株,提高3-6倍。