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苯并(a)芘(Benzo[a]pyrene,B[a]P)是烧煤和吸烟过程中最常见的化学污染物,流行病学调查和实验研究均提示B[a]P的暴露与人类肺癌的发生密切相关,但其致癌机制仍不是很清楚。Ras癌基因是早期发现的可以导致正常细胞发生恶性转化的原癌基因之一,人类40％肿瘤和Ras基因激活相关。人类Ras基因家族主要包括H-Ras、K-Ras和N-Ras三个成员。以往大量的研究都是关注Ras基因突变激活,尤其是K-Ras基因突变的致癌潜能,对Ras基因表达改变与癌发生关系研究较少。目前,在一些肺癌细胞系和肺肿瘤组织中的研究,揭示了Ras癌基因家族存在高表达现象,并且与肿瘤的发生有一定的相关性。本研究利用B[a]P的代谢衍生物反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(anti-benzo[a]pyrene-trans-7,8-diol-9,10-epoxide,anti-BPDE)诱发的恶性转化人支气管上皮细胞模型(16HBE-T),检测Ras癌基因家族的表达,并以RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)建立N-Ras稳定沉默细胞模型,检测细胞周期时相,并以软琼脂实验和裸鼠成瘤实验进行细胞表型分析,为阐明N-Ras基因在化学致癌中的作用,以及为肺癌的治疗和预防提供进一步的理论依据。
方法：
1.H、K和N-Ras基因表达水平的检测
以正常人支气管上皮细胞(16HBE-N)为对照组,经anti-BPDE恶性转化人支气管上皮细胞(16HBE-T)为实验组,分别利用RT-PCR、Western blotting和免疫细胞化学方法,检测Ras基因家族在mRNA和蛋白水平表达变化。
2.靶向N-Ras基因的RNA干扰重组质粒载体的构建
从Genbank中获得人N-Ras基因的mRNA编码区序列(NM_002524),利用invitrogen在线RNAi设计工具,设计4对特异性针对N-Ras基因的发央结构的干扰序列(short hairpin,shRNA)。将选择的序列和相应的人基因组数据库进行BLAST序列比对,确信所选择的序列和其他基因序列不具有同源性。将单链DNA退火形成双链,与酶切后的线性化pGPU6/GFP/Neo载体连接。经BamH I和Pst I酶切鉴定后,测序验证。
3.RNA干扰重组体的瞬时转染和沉默效率的检测
按照Lipofectamine TM2000说明书进行转染。转染设实验组(pGPU6/GFP/Neo-NRas-566、pGPU6/GFP/Neo-NRas--305、pGPU6/GFP/Neo-NRas-613和pGPU6/GFP/Neo-NRas-791)和对照组(序列对照组pGPU6/GFP/Neo-shNC和载体对照组pGPU6/GFP/Neo)。48 h后用RT-PCR和Western blotting检测N-Ras基因mRNA和蛋白的表达变化情况,并确定干扰效果最佳的序列。
4.MTT法检测不同转染细胞的生长增殖能力
在转染48 h后,将6组转染细胞(pGPU6/GFP/Neo-NRas-566,pGPU6/GFP/Neo-NRas-305,pGPU6/GFP/Neo-NRas-613,pGPU6/GFP/Neo-NRas-791,pGPU6/GFP/Neo-shNC和pGPU6/GFP/Neo)和未转染的16HBE-T细胞消化,制成单细胞悬液。以每孔约2×103个细胞接种于96孔板,每组设6个平行孔,共接种4块板。从次日开始每天定时取出一块板,用全自动酶表仪测定450 nm波长处各孔的吸光值。
5.建立稳定沉默N-Ras基因的16HBE-T细胞系
利用0 μg/ml、200 μg/ml、400μg/ml、600 μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml、1200μg/ml、1400μg/ml G418培养基培养16HBE-T细胞2周,确定G418的筛选浓度。在转染48h后,用含筛选浓度G418培养基选择培养转染16HBE-T细胞2周,每组挑取3个克隆,依次转移到24孔板、6孔板和20cm2培养瓶中扩大培养。经过约2个月,获得针对N-Ras基因的稳定沉默16HBE-T细胞系,并用Western blotting检测N-Ras蛋白表达水平,确定干扰效果最佳的克隆细胞系。
6.流式检测稳定沉默细胞的细胞周期
细胞在收集和用PBS洗涤后,用70％预冷乙醇固定过夜,加入终浓度20μg/ml PI和终浓度200μg/ml RNase A,避光染色30 min后,用流式细胞仪检测。
7.软琼脂实验检测稳定沉默细胞的集落形成率
在6孔板中,每孔制备2 ml底层琼脂(按1:1比例无菌混合1.2％低溶点琼脂糖和2×MEM培养基),待其冷却凝固后,再制备每孔含1000个细胞的2 ml顶层琼脂(按1:1比例无菌混合0.7％低溶点琼脂糖和2×MEM培养基),置于37℃ CO2温箱中培养14 d,观察集落形成率。
8.裸鼠成瘤实验鉴定稳定沉默细胞的恶性程度
5周龄BALB/c裸鼠24只,随机分为3组。约5×106个细胞接种于裸鼠右侧颈部与背部交界皮下。观察肿瘤出现时间,待其出现后,每3天用游标卡尺测量肿瘤长径a和短径b,按下列公式计算瘤体积,即V=1/2×ab2。4周后,取出瘤组织,称量瘤重。每组取出部分瘤组织浸泡于10％甲醛中,送病检。
9.统计分析
各实验组数据均以均数±标准差(-x±s)表示,并根据资料性质,利用SPSS15.0统计软件分别进行方差分析和组间t检验。P<0.05为有显著性差异。
结论：
1.anti-BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在H-Ras、K-Ras和N-Ras基因过表达,N-Ras表达改变最显著。
2.成功构建四对N-Ras基因的shRNA真核细胞表达载体,筛选出最佳干扰载体pGPU6/GFP/Neo-NRas-566,并建立了N-Ras基因稳定沉默细胞系,为N-Ras基因功能的进一步研究奠定了基础。
3.沉默N-Ras基因表达可以抑制16HBE-T细胞的增殖,且细胞的生长增殖能力与N-Ras基因表达正相关。稳定沉默N-Ras基因表达可以诱导16HBE-T细胞的G0/G1期捕获、减慢细胞周期进程、降低16HBE-T细胞的集落形成率、抑制肿瘤生长。
4.H-Ras、K-Ras和N-Ras基因的激活可能参与anti-BPDE诱导肺癌的发生。N-Ras基因高表达与16HBE-T细胞的恶性潜能相关,N-Ras癌基因可能成为潜在的肺癌治疗靶点。