目的:本研究进一步探讨NADPH氧化酶NOX4介导的氧化应激对高糖刺激足细胞损伤及产生微囊泡过程中的作用。方法:体外培养MPC-5细胞,高糖组处理因素为30mM葡萄糖。1.采用RT-qPCR、Western Blot技术分别检测高糖刺激MPC-5细胞2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后NOX4 mRNA、蛋白的水平,确定高峰时间点。2.对MPC-5细胞进行FAM-si RNA转染,浓度范围为0-150nM,荧光显微镜观察荧光,确定最佳转染浓度。3.以最佳浓度对MPC-5细胞进行siRNA转染,采用RT-qPCR技术筛选转染率最高的siRNA序列。4.将MPC-5细胞分为6组,分别为正常组、NOX4 siRNA组、阴性siRNA组、高糖组、高糖+NOX4 siRNA组、高糖+阴性siRNA组,高糖干预时间为方法1中NOX4蛋白水平高峰时间点,采用Western Blot技术检测各组NOX4蛋白的水平,采用ELISA技术检测各组MPC-5细胞产生MVs的含量。5.统计学方法:采用SPSS 18.0统计软件分析数据。结果用均数±标准差(sx?)表示。两组以上比较采用单因素方差分析(ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.NOX4 mRNA检测结果:随高糖刺激时间的延长,NOX4 m RNA表达水平呈先升高后降低的趋势,与正常对照(NC)组相比,2小时、4小时、6小时、12小时、24小时分别是NC组的2.61、1.94、1.83、1.52、1.11倍,可见2小时达高峰,随后逐渐下降,差异有统计学(P<0.01)。2.NOX4蛋白检测结果:随高糖刺激时间延长,NOX4蛋白表达量呈先升高后降低的趋势,与正常对照(NC)组相比,2小时、4小时、6小时、12小时、24小时分别是NC组的1.14、2.08、1.63、1.51、0.96倍,可见4小时达高峰,随后逐渐下降,差异有统计学(P<0.01)。3.FAM-siRNA转染MPC-5细胞结果:荧光显微镜下观察足细胞内可见绿色荧光,当siRNA浓度在50-125nM之间时,随siRNA浓度增加,含有绿色荧光的细胞数目逐渐增多,当si RNA浓度达150nM时,可见多数细胞被杀伤,说明siRNA浓度为125nM时转染效率最佳。4.不同序列siRNA转染足细胞NOX4 mRNA检测结果:与正常对照组、lipo2000组、阴性siRNA组、siRNA-A组、siRNA-C组相比,siRNA-B组NOX4mRNA表达水平明显降低(P<0.05),说明siRNA-B序列干扰NOX4基因的效率最佳。5.NOX4 siRNA转染后高糖刺激足细胞NOX4蛋白检测结果:NOX4 siRNA组(2组),与正常组(1组)相比,NOX4蛋白表达降低了54.1%(P<0.01);高糖组(3组),较1、2组NOX4蛋白表达升高,分别为1、2组的2.20、4.79倍(P<0.01);高糖+NOX4 siRNA组(4组),与3组相比,NOX4蛋白表达降低了59.7%,为2组的1.93倍(P<0.01);阴性siRNA组、高糖+阴性siRNA组,分别与1、3组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。6.NOX4 siRNA转染后高糖刺激足细胞产生MVs检测结果:NOX4 siRNA组,较正常组(1组)MVs浓度降低17.6%(P<0.05),高糖组(3组),较1、2组MVs浓度升高,分别为1、2组的2.1、2.55倍(P<0.01);高糖+NOX4 siRNA组(4组),与3组相比,MVs浓度降低了48.0%(P<0.01),较2组升高24.5%(P<0.01),与1组差异无统计学意义(P>0.05);阴性siRNA组、高糖+阴性siRNA组,分别与1、3组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.高糖可以增加足细胞NOX4 mRNA及蛋白的表达,呈时间依赖性。2.高糖可以刺激足细胞MVs产生增加,NOX4 siRNA干扰后足细胞MVs产生减少。3.高糖可能主要通过增加NADPH氧化酶NOX4来源的氧化应激而促进足细胞产生MVs。