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越来越多的证据表明同型半胱氨酸(HCY)是心血管疾病的独立危险因子之一,但其致病的确切病理生理机制尚不完全清楚。血管内皮是覆盖于血管内面的一层单层细胞,内皮细胞(EC)的结构损伤和功能紊乱是心血管疾病的发病基础。研究HCY对EC的损伤对我们了解HCY的致病机理有重大帮助,是目前研究心血管病发生、发展的一个热点。本研究的目的旨在:观察HCY对EC结构的损伤和功能改变,整体把握HCY对EC蛋白质表达的变化。为达到以上研究目的本课题分成以下三部分:⑴ HCY对人脐静脉(HUVEC)凋亡的影响:凋亡是不同于坏死的程序性细胞死亡,内皮细胞增生和凋亡的平衡失调可能是动脉硬化(AS)发生的重要原因。培养HUVEC,以传代培养的第2~3代细胞为实验对象,HCY以不同浓度或不同的作用时间进行干预。通过光镜和电镜观察HCY对HUVEC的结构损伤;检测培养上清液中的LDH反映细胞损伤的程度;用细胞四唑盐(MTT)比色方法观察HCY对细胞增殖的影响;以流式细胞仪和细胞基因组DNA电泳方法观察细胞凋亡的发生率。结果发现,正常培养的内皮细胞存在低比率的凋亡细胞,随着HCY浓度的增高或作用时间的延长,凋亡细胞的比率明显增加(P<0.05),细胞损伤的程度也明显增强,1mmol/L HCY作用于细胞24小时,其凋亡细胞的百分比达到最高,为17.6%,同时其培养液上清液LDH测值最高,而MTT值最低。HCY对HUVEC的损伤呈浓度和时间依赖性。细胞超微结构显示核染色质浓缩、边积和细胞核碎裂等现象。凋亡细胞的基因组DNA电泳呈梯状带。结果提示HCY能诱导内皮细胞凋亡、对细胞具有细胞毒性作用,且其作用存在浓度和时间的依赖性。 <WP=6>⑵ HCY对HUVEC表达TAFI和TFPI的影响:凝血酶激活的纤溶抑制物(Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor, TAFI)和组织因子途径抑制因子(Tissue factor passway inhibitor,TFPI)是近年来受到国内外高度重视的由血管内皮细胞分泌的生理性凝血调节因子。HCY以不同浓度或不同的作用时间进行干预传代培养的第2~3代HUVEC。通过RT-PCR和Western-Blot方法从mRNA水平和蛋白质水平研究HCY对HUVEC表达TAFI和TFPI的影响。结果表明正常情况下在内皮细胞内可检出TAFI和TFPI的表达,HCY对内皮细胞表达TAFI和TFPI的影响在基因和蛋白质水平均得到反映。随着HCY浓度的升高或作用时间的延长,HUVEC表达TAFI的量逐渐增加,而TFPI的量逐渐降低。提示HCY可抑制血管内皮细胞的抗凝与纤溶能力,破坏机体凝血和纤溶之间的平衡,这是HCY引起血管内皮功能紊乱,是导致血管病变和血栓形成的一个机制。⑶ 同型半胱氨酸对内皮细胞蛋白质组影响的双向凝胶电泳分析:内皮细胞是覆盖于动脉、静脉、淋巴管等管腔内的单层细胞,对人体的生理与病理变化具有重要作用。HCY对内皮细胞的损伤可表现在对内皮细胞屏障和再生功能的损害、对内皮依赖舒张功能(EDVR)的损害、对内皮抗凝和纤溶功能的损害和对内皮粘附功能的影响等多个方面。以往研究HCY对内皮细胞的损伤,多只能关注其中的某一个方面或某一点,难以全面了解内皮细胞受损后的变化。而蛋白质组学的分析方法可以从整体上研究HCY作用后内皮细胞基因表达谱改变,对于了解HCY损伤内皮细胞的全貌,以及揭示损伤发生的机制具有非常重要的意义。以0.1mmol/L和0.5mmol/L的HCY干预培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304,收集细胞总蛋白,用双向凝胶电泳的方法观察细胞在HCY作用前后和作用不同时间后蛋白质表达的变化。结果显示内皮细胞的蛋白的分子量多在80kDa以下,等电点PI在4～8之间。每张图谱平均斑点数为403±47,HCY作用前后和作用不同时间细胞表达的<WP=7>蛋白质有明显不同。HCY作用后可见8种蛋白质表达量明显增加,22种蛋白质表达量明显减少。随着HCY浓度的升高15种蛋白质表达量明显下调,2种蛋白质表达量明显上调。有14种蛋白只在正常培养的细胞中表达。本实验揭示HCY对内皮细胞存在多方面的作用,能诱导细胞凋亡,引起细胞功能紊乱,影响细胞蛋白质组。以上这些对揭示HCY的致病机理有重要意义。