多酶级联反应可以实现从低成本的简单化合物合成高附加值的复杂化合物,因而在大规模生物转化工艺中发挥着日益重要的作用。然而,如何提高级联多酶的协同作用和催化效率仍然面临着巨大的挑战。天然的级联多酶通常组装为多酶复合体或是形成亚细胞区室,使得酶与酶在空间上临近,形成底物通道,从而增强多酶的协同作用和催化效率。近年来,研究者模仿天然的多酶组装策略开发了多种类型的多酶组装方法,并有效地提高了人工多酶级联途径的转化效率。本课题以合成L-叔亮氨酸的双酶级联反应途径为模式体系,通过多种方式对该模式体系进行组装,并研究人工多酶组装体的性质,以期能够建立一种简单、经济、高效的多酶组装策略。主要内容分为以下4个部分：(1)合成L-叔亮氨酸的双酶途径的建立及其胞内融合组装通过基因工程的手段分别构建了双酶途径中的甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶,并在大肠杆菌中实现了它们的可溶表达。通过对双酶反应的温度、pH、底物浓度等条件进行优化,建立了该双酶途径的反应体系。结果表明,在最适条件下,双酶反应可以在6小时内将92%的600 mM底物转化为L-叔亮氨酸,ee值为95%。通过基因融合的手段对两酶进行融合,并利用不同的连接短肽对融合酶进行优化,成功实现了融合酶的可溶表达。结果表明刚性ER/K连接短肽可以有效地提高融合酶的可溶表达水平和催化效率。然而,与共表达的情况相比,融合表达导致酶的可溶表达水平降低,催化活力下降。此外,融合酶的稳定性较差,容易受到外界环境变化的影响。(2)双酶合成途径的胞外共固定组装利用PD-IONPs纳米材料对双酶途径进行了共固定化,结果表明共固定化后亮氨酸脱氢酶的活力几乎没有损失,然而甲酸脱氢酶只有微弱的活力。为提高甲酸脱氢酶的固定化酶活力,通过定点突变建立了一种酶定向的固定化方法。根据甲酸脱氢酶的同源结构模型设计了7个甲酸脱氢酶的突变体,并研究了突变对固定化甲酸脱氢酶的影响。结果表明突变体C-c的固定化率和固定化酶活力最高,其酶活回收率约为野生型甲酸脱氢酶的3倍。此外,将C-c与亮氨酸脱氢酶进行共固定化后,发现其催化效率与共固定化的野生型甲酸脱氢酶／亮氨酸脱氢酶相比,有了显著提高。(3)双酶合成途径的胞外和胞内超分子自组装为建立可同时实现双酶合成途径在胞外和胞内组装的方法,本课题利用相互作用蛋白／短肽的异源结合特性和多聚体酶的同源自聚特性开发了一种多酶超分子自组装方法。将相互作用蛋白结构域PDZ和它的配体分别与亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶进行基因融合,通过融合蛋白在胞外混合或在胞内共表达的方式,成功实现了两酶的超分子自组装。利用动态光散射、蛋白电泳、原子力和扫描电子显微分析、双分子荧光互补标记等技术对胞外和胞内多酶组装体系进行了表征和优化。胞外形成的超分子多酶体为二维层状结构,组装的最佳比例为亚基摩尔比1：1,而且组装的速率和转化率具有显著的浓度依赖性。胞内组装主要发生在诱导表达后的9-18 h,形成的超分子多酶体为微米级的二维层状结构,主要以包涵体形式存在于细胞的两级。此外,与未组装的酶相比,胞内和胞外形成的超分子多酶体的催化效率更高,说明组装后两酶之间形成了辅酶传递的通道,提高了辅酶的传递效率。(4)超分子多酶体的后修饰研究超分子多酶体的尺寸较大,可以作为固体催化剂重复使用。为增强超分子多酶体的可重复使用性,对其进行了二硫键修饰。PDZ-配体的结构显示PDZ上的Asn24和配体上的Val2在空间上相互临近,而且不影响PDZ与配体的结合,因而被选择作为引入二硫键的位点。通过定点突变将这两个氨基酸残基突变为半胱氨酸,成功的在超分子多酶体的组装界面引入了二硫键。二硫键锁定显著增强了超分子多酶体的可重复使用性,重复使用8次后仍可保留80%以上的初始活力。本课题开发了一种多聚体酶的无支架自组装方法,成功实现了异源多酶在胞内和胞外的自组装,形成的超分子多酶体不仅结构高度有序,而且具有高效的多酶协同作用。此研究将为多酶的组装与固相化,胞内代谢途径的调控,以及生物纳米材料的构建提供一条简便可行的途径。