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人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)与其它疱疹病毒一样,在原发感染之后建立以潜伏感染为特征的终生感染,其机制尚不清楚。病毒编码的小分子RNA(miRNA)能在容许性细胞的裂解感染过程中对病毒或宿主基因进行转录后调控,从而调控病毒复制。其中部分病毒编码的miRNA已被证明能够抑制病毒的复制,从而有利于HCMV建立或维持潜伏感染。但HCMV编码miRNAs的功能等尚未全面认识。本研究第一部分工作中利用不同HCMV感染状态的(增殖性感染、潜伏感染、潜伏感染激活)细胞模型,定量分析了16种HCMV编码miRNAs的表达水平与动态变化,比较了其在增殖性感染、潜伏激活感染和类潜伏感染中的表达异同;选择其中差异明显、功能未知的miRNA,研究其对HCMV感染的调控作用。 HCMV感染成纤维细胞HELs、单核细胞THP-1和分化后的单核细胞d-THP-1分别代表HCMV的增殖性感染、潜伏感染和潜伏激活感染三种感染状态。利用定量RT-PCR监测HCMV感染不同细胞模型后的成熟miRNAs表达的动态变化。结果发现三种感染状态下miRNA的表达谱有着显著差异。根据表达差异和功能未知原则,选择了miR-US33、miR-UL22A和miR-UL70三个可能调控HCMV的复制的候选分子。分别建立稳定表达此3种miRNAs的HEL细胞,继而用HCMV进行感染,结果发现三种候选分子中仅miR-US33能够明显的抑制HCMV的各期蛋白(IE1/2,UL44,gB)表达、病毒基因组的复制、病毒粒子的释放。表明其对HCMV复制的抑制作用。荧光素酶活性实验进一步证实了HCMV的US29基因是miR-US33的直接作用靶标。综合以上结果,HCMV感染不同感染状态引发病毒miRNA表达谱存在明显差异;首次发现miR-US33下调HCMV的复制。这些结果有助于解析病毒由增殖性感染进入或建立潜伏感染的机制。由于缺少US29的病毒突变株病毒,所以我们无法研究在缺失了US29的条件下miR-US33对病毒复制的影响。 鉴于此我们急需建立适于大的DNA病毒进行基因缺失等操作的疱疹病毒的细菌人工染色体平台。由于HCMV等疱疹病毒基因组特别大,利用传统分子克隆手段研究疱疹病毒(如HCMV和HSV-1)特定基因功能和致病机制非常困难。细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome, BAC)是一项可容纳大分子片段(约300kb)的人工改造载体,为研究大基因组病毒提供了可用工具。我们构建了首个我国HCMV临床分离株(Han株)和HSV-1 H129株的细菌人工染色体HCMV Han-BAC和HSV-1 H129-BAC,并通过将其转染进入人胚肺成纤维细胞(HELs)和非洲绿猴肾细胞(vero)中拯救出带有绿色荧光蛋白(GFP)标记的重组病毒,并进一步比较拯救病毒与野生型病毒生长特性。利用BAC成功构建了HCMV Han-BAC和HSV-1 H129-BAC,为研究病毒基因的功能等建立了研究平台。