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目的:肾脏纤维化是以细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)的过度积聚和沉积为主要病理特征的一种肾脏病理损害,是各种慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)进展至终末期肾脏病(End-stage kidney disease,ESKD)的共同通路。其发病机制复杂,无有效的防治措施。我们前期研究发现,WNT1诱导信号通路蛋白1(WNT1-inducible signaling pathway protein 1,WISP-1)在有肾纤维化的CKD患者的肾组织、血清以及体内、外肾脏纤维化模型中表达水平均一致性的升高,且CKD患者血清WISP-1的表达随着肾组织纤维化程度的加重而明显增强,提示WISP-1可能是促进肾纤维化的因子,参与肾纤维化的发生发展。本研究旨在进一步明确WISP-1在体内外肾脏纤维化模型中的功能作用,并探讨其可能的分子机制,为肾脏纤维化的治疗提供新的思路。方法:1、利用质粒及siRNA转染技术上调或干扰WISP-1在大鼠肾小管上皮细胞株NRK52E中的表达,进一步采用定量实时聚合酶链式反应(Quantitative real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测在转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)-β1刺激24小时后,WISP-1和肾脏纤维化指标包括胶原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ,Col Ⅰ)和纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)的表达。2、利用单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction,UUO)小鼠模型构建肾脏纤维化的体内模型,将市售抗WISP-1的单克隆和/或多克隆抗体通过腹腔注射入动物体内,以抑制小鼠肾脏中WISP-1的表达。实验分组:正常组、模型组、UUO+IgG组、UUO+不同WISP-1抗体组(包括UUO+Ab1、UUO+Ab2、UUO+Ab3);利用常规病理染色(HE、PAS、Masson三色染色)观察肾脏病理、肾纤维化变化;通过免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色、qRT-PCR 及 Western blot 检测 WISP-1及纤维化指标Col I、FN和α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达。3、使用lipofectamine 3000将GFP-LC3质粒转染入NRK52E细胞,激光共聚焦荧光显微镜观察细胞中代表自噬体形成的GFP-LC3斑点的表达;利用Western blot检测各组小鼠肾组织中自噬相关标记物包括抗微管相关蛋白 1 轻链 3(anti-microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3),Beclin 1 和 SQSTM1/p62 的变化。结果:1、转染过表达WISP-1质粒的NRK52E中,WISP-1表达较空质粒组明显升高(P=7.00x10-3);而瞬时转染WISP-1的NRK52E,WISP-1表达较正常组明显减少(P=7.25x10-4)。2、TGF-β1诱导24小时后,NRK52E中Col I、FN及TGF-β1明显上升;而过表达WISP-1,TGF-β1诱导NRK52E产生的ColⅠ、FN较空质粒组进一步升高(P=3.26x10-4(Col Ⅰ)、9.50×10-5(FN));干扰WISP-1在NRK52E细胞中的表达较正常组进一步减少了TGF-β1诱导的纤维化标志物Col Ⅰ和FN的产生(P2.23×10-4(Col Ⅰ)、1.70×10-5(FN))。3、UUO小鼠腹腔注射抗WISP-1抗体7天后,UUO+WISP-1 不同抗体组的 WISP-1 在 mRNA(P=1.20×10-2(UUO+Ab1组)、3.00×10-5(UUO+Ab2 组)、9.30×10-4((UUO+Ab3 组))、蛋白(P=2.42×10-3(UUO+Ab1-组)、3.46×10-2(UUO+Ab2 组)、1.50x10-2(UUO+Ab3组))较UUO组明显降低;4、从病理表现上,相比UUO组和UUO+IgG组,UUO+WISP-1不同抗体组小鼠肾间质纤维化、细胞外基质沉积明显减轻;5、UUO+WISP-1不同抗体组小鼠肾组织的ColⅠ、FN和α-SMA的mRNA和蛋白质水平较UUO组和UUO+IgG组表达显著降低(mRNA:UUO+Ab1 组:P=3.78x10-4(Col Ⅰ)、1.35×10-2(FN)、1.98×10-2(α-SMA);UUO+Ab2 组:P=1.20×10-5(Col Ⅰ)、1.26×10-4(FN)、1.06×10-3(α-SMA);UUO+Ab3 组:P=2.00×10-6(Col Ⅰ)、1.31×10-3(FN)、4.89×10-3(α-SMA);蛋白:UUO+Ab1 组:P=9.15×10-4(Col Ⅰ)、1.67×102(FN)、1.17×10-2(α-SMA);UUO+Ab2 组:P=2.23×10-2(ColⅠ)、5.80×10-3(FN)、1.34×10-3(α-SMA);UUO+Ab3 组:P=2.76×10-2(ColⅠ)、1.55×10-1(FN)、2.46×10-2(α-SMA))。6、NRK52E 细胞中过表达 WISP-1 组 GFP-LC3 斑点较TGF-β1刺激组更多;相反,通过siRNA干扰WISP-1的表达降低了TGF-β1处理的NRK52E细胞中GFP-LC3斑点的数量。7、UUO+WISP-1不同抗体组自噬相关正向标志物LC3和Beclin 1的表达较UUO组减少(UUO+Ab1 组:P=3.00×10-5(LC3)、5.22×10-3(Beclin 1);UUO+Ab2 组:P=6.30×10-5(LC3)、1.02×10-3(Beclin 1);UUO+Ab3 组:P=4.55×10-4(LC3)、2.83×10-3(Beclin 1)),而负向标志物 SQSTM1/p62 的表达增加(UUO+Ab1组:P=7.05×10-2;UUO+Ab2 组:P=1.25×10-2;UUO+Ab3 组:P=4.81×10-2)。结论:1、过表达WISP-1可明显加重TGF-β1诱导的大鼠肾小管细胞的纤维化反应,而降低WISP-1可以减轻TGF-β1诱导的大鼠肾小管细胞的纤维化反应。2、抗WISP-1治疗能明显减轻UUO模型小鼠的肾脏病理损害和肾脏纤维化。3、在TGF-β1处理的大鼠肾小管上皮细胞和UUO小鼠模型中WISP-1可能通过诱导自噬来介导肾纤维化。4、WISP-1作为促纤维化因子,可能作为肾纤维化治疗的潜在靶点。