立枯丝核菌AG1-IA侵染不同寄主差异表达基因分析及一个诱发植物细胞死亡的分泌蛋白功能研究

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Rhizoctonia solani AG1-IA是引起水稻纹枯病的致病菌,而水稻纹枯病在全世界水稻种植区频繁发生,并且有逐年加重的趋势。该病害的发生可以导致水稻减产和稻米品质降低,由此造成严重的经济损失。立枯丝核菌AG1-IA作为丝核菌属中第一个基因组测序的菌株,可以为研究其对水稻的致病机制提供一个很好的模型。论文通过对不同寄主来源的立枯丝核菌AG1-IA侵染水稻、玉米、大豆的转录组测序数据所产生的差异基因进行进一步的分析和挖掘,为探寻立枯丝核菌AG1-IA侵染不同寄主在转录水平的差异机制和关键基因的筛选奠定一定基础。首先,本研究采用实时荧光定量的方法对转录组数据的准确性进行了验证,借助Edge R软件总共鉴定了2319个差异表达的基因,其中筛选到104个差异表达的候选效应蛋白中有64个存在上调表达。同时,揭示了不同寄主来源的立枯丝核菌AG1-IA菌株侵染不同寄主或者同一寄主时致病相关基因(主要包括候选效应因子、碳水化合物酶等)的差异表达模式,这些差异表达的基因也可以反应立枯丝核菌AG1-1A对不同寄主植物的适应性。在本研究中还发现可变剪切在立枯丝核菌AG1-IA菌株侵染不同寄主时的差异基因中存在较高比例,特别是一些和致病性相关的基因。另外,立枯丝核菌AG1-IA菌株在侵染不同寄主时碳水化合物酶基因的表达存在偏好性,在侵染水稻过程中,水解纤维素、半纤维素和淀粉的碳水化合物酶可能更为必要;在侵染玉米过程中可能需要更多水解纤维素、半纤维素和几丁质降解的碳水化合物酶参与,在侵染大豆期间降解果胶的碳水化合物酶可能更为重要。本论文利用农杆菌介导的瞬时表达体系,对10个预测的富含半胱氨酸分泌蛋白能否引发本氏烟产生细胞程序性坏死进行了筛选和鉴定,并对其中能激发植物细胞程序性死亡反应的分泌蛋白(暂命名为Rs IA_CEP32)进行了功能研究。研究结果表明,在立枯丝核菌AG1-IA中首次发现富含半胱氨酸的小分泌蛋白Rs IA_CEP32能够引起烟草细胞死亡,但是,去掉信号肽过后则不能引起烟草细胞死亡,信号肽功能验证确定其信号肽能正常行使功能。序列同源性分析表明,Rs IA_CEP32是立枯丝核菌属中比较保守且特有的基因,并且该基因存在强烈的正向选择,其第101位氨基酸位点对其功能的发挥具有重要影响。它在水稻纹枯病菌侵染不同纹枯病抗性的水稻品种(特青和雷蒙特)的过程中均受到强烈的诱导表达,并且在侵染前期呈现持续性的上调表达。它在本氏烟中的瞬时表达时,能够激发本氏烟的抗病防御相关基因的表达和导致H2O2的积累。烟草亚细胞定位结果显示,Rs IA_CEP32基因不存在定位偏好性。虽然Rs IA_CEP32对酵母菌株没有毒性,但是存在自激活。采用GST Pull-down方法筛选寄主靶蛋白,目前已经初步获得10个候选靶蛋白基因。
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