乙型肝炎(Hepatitis B,HB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起、危及全球人类健康的传染病,面对3.5亿HBV慢性感染的患者,目前还没有有效的疫苗对其治疗。阻断肝细胞内HBV的复制和表达、诱导有效的免疫应答仍是目前难题之一。其中,最主要的原因是缺乏HBV慢性感染的小鼠模型和有效HBV抗原交叉提呈,对HBV住肝脏细胞中的复制及抗原表达与免疫应答的关系尚没有非常清楚。Chen等在AAV骨架的基础上改进并建立了HBV-DNA载体-pAAV／HBV1.2x,同样采用尾静脉快速注射方法在正常C57BL／6小鼠体内,成功地建立了HBV肝炎小鼠模型,使得HBV复制及抗原表达长达一年,该新型小鼠模型为研究HBV慢性感染的病毒学和免疫学机制提供了首要条件。　　 病毒是专性细胞内感染微生物,细胞免疫在控制病毒感染中发挥关键作用。Chisari等研究证实在HBV急性感染的小鼠体内CD8+T细胞的清除作用并不依赖CD8+T细胞的直接杀伤、而是通过分泌细胞因子(主要为IFN-γ、TFN-α)发挥清除作用,但这些细胞因子如何发挥清除HBV作用尚不清楚。实验研究与临床资料都显示,HBV慢性感染机体常表现为HBV特异性CD8+T细胞应答低下,但其中的确切原因尚不清楚,但我们推测:HBV慢性感染机体存在的CD8+T细胞应答低下与缺乏有效的交叉提呈有关。　　 肿瘤抗原的交叉提呈,需要供体细胞具有完整的自噬功能、与肿瘤细胞的自噬密切相关。研究发现:采用自噬诱导剂处理肿瘤细胞可以提高交叉提呈的效率,而采用自噬抑制剂处理肿瘤细胞或siRNA沉默自噬基因Beclin1及Atg12则阻断交叉提呈。而抗原的交叉提成对诱导适应性免疫应答抵抗肿瘤和病原体的感染至关重要。从转染HBV的肝癌细胞HepG2.215提取的自噬小体(HBV-DRibbles)是从肿瘤细胞培养上清提取的具有双层膜结构的自噬小体,其中含有阻断蛋白酶体降解途径而残留的废蛋白(defectiveribosome products,DRips),作为新型的治疗HBV的疫苗,本实验结果显示:能够有效的交叉提呈HBV抗原,诱发针对HBV的特异性的T细胞应答。但是传统的HBV-DRibbles的提取方法存在着细胞量大、成本高、时间长、获取的HBV-DRibbles量少等局限。不利于大量提取HBV-DRibbles,在本文中我们建立了一种方法优化从人肝癌细胞中进行HBV-DRibbles的提取,并探讨提取的HBV-DRibbles免疫小鼠在诱导细胞应答以及对借助尾静脉高压注射HBVpAAv质粒而建立HBV肝炎小鼠模型的体内HBV的复制作用的研究。结果我们的数据证实,HBV-DRibbles与重组HBsAg相比,能够诱导明显的HBV特异的抗体应答和T细胞介导的的免疫反应,并且HBV-DRibbles免疫的小鼠体内HBV的复制能得到抑制。我们下一步的目标是探讨HBV-DRibbles在已建立成熟的HBV肝炎小鼠模型体内对减少或抑制HBV复制的治疗作用。　　 另外在本实验优化HBV-DRibbles的过程中,发现蛋白酶体抑制剂对HepG2.215肝癌细胞内转染的HBV具有抑制作用,我们针对此现象展开了探讨蛋白酶体抑制剂Velcade埘肝癌细胞表面MHCA／B类分子、MHC-I分子的表达及CIK细胞对Velcade处理的肝癌细胞杀伤作用的影响。由于CIK是目前一种新型的肿瘤生物治疗的效应细胞,但单独使用CIK的治疗效果并不理想,那么联合Velcade是否能够增强CIK的杀伤效用将会对临床起到重要的指示作用。采用流式细胞仪检测经蛋白酶体抑制剂Velcade处理后的肝癌细胞表面MICA／B、MHC-I分子表达水平和CIK细胞对Velcade处理的肝癌细胞杀伤作用。结果显示肝癌靶细胞经蛋白酶体抑制剂Velcade处理后MICA／B表达增加、MHC-I分子表达降低,进而增强了CIK细胞对Velcade处理的肝癌细胞的杀伤活性。那么我们体外证实联合蛋白酶体抑制剂Velcade和CIK细胞为基础的免疫治疗有助于提高肝炎引发肝癌的综合治疗效果。为CIK的体内输注疗法提供了一个新的治疗思路。　　 本研究以转染HBV-DNA的肝癌细胞-HepG2.215为研究对象,探讨优化HBV-DRibbles疫苗的途径,用优化的HBV-DRibbles疫苗免疫小鼠,检测小鼠体内抗体产生水平以及发生的免疫应答。另外体外探讨蛋白酶体抑制剂Velcade对HepG2.215肝癌细胞MICA／B、MHC-I分子的表达及CIK细胞杀伤活性的影响。　　 目的:　　 1.本研究以转染HBV-DNA的肝癌细胞-HepG2.215为研究对象,探讨优化与制备HBV-DRibbles疫苗的方法；实施HBV-DRibbles疫苗免疫,观察其诱导HBV特异性免疫应答及其抗HBV感染的作用。　　 2.探讨蛋白酶体抑制剂Velcade对肝癌细胞MHC-I类分子和MICA／B的表达及CIK细胞杀伤敏感性的影响。　　 方法:　　 1.HBV疫苗的优化与制备及其诱导的免疫应答　　 1.1体外培养HepG2.215细胞24小时,待贴壁良好,密度适中(细胞单层覆盖培养瓶底部80％以上),分别使用自噬诱导剂Rapamycin、蛋白酶体抑制剂Velcade、NH4CL、自噬小体溶酶体融合抑制剂L-asparagine单独和组合干预HepG2.215细胞24小时,梯度离心收获上清中自噬小体(HBV-DRibbles)。用RIPA裂解液裂解收获的HBV-DRibbles30秒,10000rpm离心4分钟收获上清,然后用ELISA法检测各样本HBsAg、HBeAg的变化。　　 1.2采用淋巴结注射法对C57BL／6小鼠分别进行HBsAg重组疫苗免疫(80μg·40μL·只)和HBV-DRibbles免疫(80μg·40μL·只),并设空白对照组。2周后分别皮下注射加强免疫HBsAg重组疫苗免疫(400μg·200μL·只)和HBV-DRibbles免疫(400μg·200μL·只),连续加强2次,5周后小鼠眼眶采血并分离血清。ELISA检测血清中抗HBs抗体的产生情况。　　 1.3选用抗HBs抗体阳性的小鼠处死,收获脾脏及淋巴结并制备单细胞悬液,用含10％小牛血清的RPIM1640完全培养液重悬将脾细胞加入48孔细胞培养板,脾细胞终浓度为2×106／ml；做相同脾细胞浓度的HBcAg、HBsAg、HBV-DRibbles刺激实验,设HBcAg终浓度为500、50和0(ng／ml)3个浓度组,设HBsAg终浓度为100、30和0(ng／ml)3个浓度组,设HBV-DRibbles终浓度为10、3和0(ng／ml)3个浓度组与脾细胞共孵育；培养72小时后收集培养上清并采用ELISA法检测上清中IFN-γ的含量。　　 1.4采用尾静脉高压注射法在HBV-DRibbles免疫的C57BL／6小鼠注射10μg pAAV／HBV质粒,注射过程在5s钟内完成。定期眼眶静脉采血,收集血清样本,然后用定量PCR检测血清中的HBV-DNA拷贝数,在预定的时间处死小鼠取肝组织,免疫组织化学染色法检测肝内HBcAg,石蜡包埋肝脏组织,兔抗HBc抗体PV-6001两步法。肝脏组织切片同时做苏木素-伊红染色。免疫组织化学方法检测肝细胞内的HBcAg。　　 2.蛋白酶体抑制剂Velcade对CIK细胞杀伤肝癌细胞活性的影响　　 2.1用含10％胎牛血清、100U／ml青霉素和100U／ml链霉素的DMEM培养基,调整肝癌细胞浓度为1×106细胞／每孔(6孔培养板)按照实验设计分组,实验组加入200nM的Velcade,并以不加药物为空白对照组。于37℃饱和湿度、体积分数为5％CO2的培养箱中培养24h。Velcade培养肝癌靶细胞24小时后,收集细胞培养的上清和用RIPA裂解后的上清使用乙型肝炎表面抗原诊断试剂盒、乙型肝炎e抗原诊断试剂盒进行检测。　　 2.2 Q-PCR检测Velcade处理后细胞裂解液中的HBV-DNA拷贝数。　　 2.3细胞流式检测Velcade处理靶细胞的M ICA／B、MHC-I分子的表达。　　 2.4MTT法检测CIK对Velcade处理靶细胞HepG2.215细胞的杀伤活性,计算杀伤效率。　　 2.5将预先用Velcade处理的肝癌靶细胞和未加药处理的肝癌靶细胞分别设为实验组和对照组,实验组用0.5μM浓度的CFSE,对照组用20μM浓度的CFSE进行差异染色,置于细胞培养箱中培养15min。待细胞被Cfse充分标记后,将细胞用PBS洗涤三次,去除残留的荧光染料。分别将Velcade处理和不处理的靶细胞(HepG2.215)按效靶比10:1、50:1、100:1分为三大组,每孔分别加入1×106、2x106、1x105个靶细胞。然后将诱导好的CIK细胞浓度调整为1×107／孔加入三组靶细胞。并设不加效应细胞的两种单独靶细胞组(1×106／孔)。加入含10％胎牛血清的RPMI-1640与F12以1:1配制的混合培养基,置于细胞培养箱中共孵育20小时。1000rpm低速离心10分钟后收获各组细胞,加入500μl PBS溶液重悬细胞后,置于流式检测管中,避光置于冰盒中上机流式检测。　　 结果:　　 1.HBV疫苗的优化与制备及其诱导的免疫应答　　 1.1浓度为100nM的Rapamycin提高了HBV-DRibbles中抗原的含量,浓度为200nM的Velcade提高了HBV-DRibbles中抗原的含量,浓度为100mM的L-asparagine,提高了HBV-DRibbles内HBsAg的含量,降低了HBeAg含量,浓度为30mM的NH4CL提高了HBV-DRibbles中抗原的含量。　　 1.2四种药物组合作用HepG2.215细胞后,明显提高了HBV-DRibbles中抗原的含量,统计学计算有意义。　　 1.3 HBV-DRibbles免疫小鼠,与同剂量的HBsAg免疫组相比,诱导了高水平的抗体Anti-HBs IgG,同时检测发现HBV-DRibbles刺激脾细胞比同剂量HBsAg、HBcAg刺激脾细胞相比产生高水平的IFN-γ提示诱导产生了HBV特异性的细胞免疫应答。　　 1.4用HBV-DRibbles免疫小鼠,动态监测HBV肝炎小鼠模型的HBsAg、HBV-DNA、HBcAg,感染6周后,对照组仍然HBsAg阳性,但是HBV-DRibbles免疫小鼠血清中的HBsAg已检测不到,血清中HBV-DNA复制的水平均明显低于对照组。免疫组织化学法检测,HBV-DRibbles免疫小鼠肝细胞内的HBcAg几乎检测不到,而对照组小鼠肝细胞内HBcAg表达明显。　　 2.蛋白酶体抑制剂Velcade对CIK细胞杀伤肝癌细胞活性的影响　　 2.1200nM的Velcade与HepG2.215细胞共孵育24小时,可以明显降低HepG2.215细胞表面的MHC-I类分子的表达,明显增高HepG2.215细胞表面的MHCA／B类分子的表达。　　 2.2效应细胞CIK对Velcade处理的肝癌靶细胞HepG2.215的杀伤率明显高于Velcade不处理的对照组。　　 结论:　　 1.HBV疫苗的优化与制备及其诱导的细胞应答　　 1.14利自噬相关药物联合作用HepG2.215细胞可提高HBV-DRibbles中抗原含量；　　 1.2 HBV-DRibbles免疫小鼠能诱导特异性抗体应答和细胞应答；　　 1.3 HBV-DRibbles诱导的免疫应答能有效清除HBV感染的肝细胞并使血清HBsAg含量、HBV-DNA拷贝数下降。　　 2.蛋白酶体抑制剂Velcade对CIK细胞杀伤肝癌细胞活性的影响　　 2.1蛋白酶体抑制剂Velcade对HepG2.215细胞HBV复制具有抑制作用；　　 2.2蛋白酶体抑制剂Velcade可以下调HepG2.215细胞表面MHC-I分子、上调HepG2.215细胞表面MICA／B分子；　　 2.3蛋白酶体抑制剂Velcade处理HepG2.215细胞能提高CIK细胞对其杀伤敏感性。