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基因治疗对于纠正基因缺陷及治疗后天获得性疾病意义重大,将会引起此类疾病治疗的革命性变革。在此领域中,将目的基因递送到靶细胞或组织的优良载体是目前研究的一大热点问题,受到广泛关注。但目前基因载体存在体内转染效率低、成本高的问题,因此本课题的研究重点在于寻求价格低廉、体内外高效转染的新型基因传递载体,同时在制备方法上寻求创新。具体研究内容如下: 1.基因传递载体材料的筛选及处方优化 本研究创新性的利用Langmuir膜天平对阳离子脂质材料双十烷基二甲基溴化铵(BD10)、双十二烷基二甲基溴化铵(BD12)和双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB),辅助性脂质-胆固醇(Cholesterol,Chol)、胆固醇-琥珀酰-聚乙二醇(CHS-PEG1500)、单甲氧基聚乳酸-羟基乙酸(mPEG2000-PLGA8000)和OA进行单分子膜和混合单分子膜性质考察,以膜弹性作为评价指标,筛选出成膜效果最佳的阳离子脂质及最稳定的混合分子膜,得到优化的基因载体处方。 2.载体/DNA复合物制备 制备方法上创新性的先将阳离子脂质DODAB与DNA孵育,再辅以辅助性脂质制得新型包含DNA的类胶束DNA复合物。以制备方法、复合物粒径、Zeta电位、外观形态作为指标,评价新脂质/DNA复合物制备方法的优势。通过对薄膜分散法、注入法、稀释法和反向蒸发法的考察,及不同溶剂、分散介质和分散方法的比较,最终选取乙醇注入法作为载DNA复合物的制备方法。 3.载DNA复合物理化性质的研究 常规方法制备的阳离子脂质体DODAB/Chol/OA粒径为160.5nm,Zeta电位为57.8mV;新型制备方法得到的DODAB/CHS-PEG1500/OA粒径为77.26nm,Zeta电位为16.7mV,DODAB/mPEG2000-PLGA8000/OA粒径为85.62nm,Zeta电位为13.1mV。琼脂糖凝胶电泳显示DODAB/Chol/OA与DNA的质量比为64/1时,能与DNA完全结合;后两者质量比为4/1时可以完全结合。 4.体外转染实验 采用自制基因载体及阳性对照-Lipofectamine2000作为载体,转运双报告基因pGL3-control和pRL-TK质粒DNA,分别转染NIH3T3、COS-7、MCF-7和B16细胞,同时考察了不同浓度血清对转染效率的影响。结果显示,采用传统方法制备的脂质体能进行有效的基因转染,但对血清因素较为敏感;而新方法制备的基因载体对血清因素不敏感。 5.细胞摄取机制的研究 NIH3T3细胞对载DNA复合物的摄取实验表明,本实验设计的基因载体主要通过细胞吞噬进入胞内,同时也存在细胞融合现象。这为高效的体内外基因转染提供了理论支持。 6.基因载体的细胞毒性实验 以NIH3T3、COS-7、MCF-7和B16细胞作为模型,评价基因载体的细胞毒性。结果表明采用新方法制备的载体由于阳离子成分少,同时载体/DNA复合物表面无强烈的正电荷存在,对细胞活性影响较小,因此未表现出明显毒性。 7.基因载体介导的siRNA干扰实验 自制基因载体包裹干扰HBV的siRNA,并转染HepG2.2.15细胞系,考察其抗乙肝病毒效果。结果显示,所制备的基因载体能有效地将所载siRNA转染HepG2.2.15细胞,采用ELISA检测到HBsAg被有效抑制,RT-PCR检测到HBVDNA含量也明显下降。表明自制基因载体能高效转染细胞,发挥抗HBV效果。 8.载抗HBVsiRNA新型复合物的肝靶向性验证-活体成像 为更好地发挥抗HBV效果,加入长循环主动肝靶向分子-半乳糖苷G20DE,采用Langmuir技术筛选处方,以优化后的处方包裹荧光染料-Cy5.5,用活体动物成像技术验证载抗HBVsiRNA新型复合物的肝靶向性。结果表明该新型复合物有显著肝靶向作用。 结论:本文对新型基因载体的组成、处方及制备方法进行了系统研究,初步得到了转染效率接近或高于商品化转染试剂的体外转染基因载体复合物,同时验证了载抗HBVsiRNA基因载体的肝靶向性。