论文部分内容阅读
燃料乙醇是公认的最有发展前景的可再生清洁能源之一。以木质纤维素类生物质资源生产燃料乙醇不仅能够降低燃料乙醇生产原料的成本,同时在废弃物处理、环境保护等方面均起到重要的作用。葡萄糖和木糖是木质纤维素水解液中的主要糖类。但对于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等传统的乙醇发酵工业菌种来说,由于其本身并不具有木糖代谢流,所以无法有效地利用木糖。因此,若想实现以木质纤维素为原料,通过微生物发酵的方法生产燃料乙醇,就必须解决菌种问题。本文选择发酵性能优良的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W5和具有木糖代谢途径的休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)20335为出发菌株,通过原生质融合和基因工程育种两种手段,选育酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌,使其获得利用木糖的能力,并能相对高效地利用木糖、葡萄糖混合碳源生产乙醇。采用原生质体融合方法,以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W5和休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)20335为亲本菌株,摸索并确定了其原生质体制备的最佳条件和灭活剂量。选用灭活原生质体的方法做为筛选标记,选取经不同灭活方式处理的双亲株原生质体进行融合,最终筛选出四株融合株,其混合碳源乙醇得率均高于双亲株。其中,HDY2-14的混合碳源乙醇得率最高,为0.31g/g,比亲本株W5(乙醇得率0.258g/g)和20335(乙醇得率0.269g/g)分别提高了20.2%和15.2%。采用基因工程育种的手段,构建了以URA3介导的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)低拷贝整合表达载体pZMYBXl和rDNA介导的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)高拷贝整合表达载体pZMYX2。其中,质粒载体pZMYBX1含有用于重组菌筛选的Blasticidin抗性基因bsd,木糖还原酶基因xyll；质粒载体pZMYX2含有用于重组菌筛选的G418抗性基因KanR,木糖醇脱氢酶基因xyl2和木酮糖激酶基因xksl。通过醋酸锂转化法,将线性化的质粒载体pZMYBX1(StaⅠ)和pZMYX2(HpaⅠ)共同转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W5完整细胞。最终获得3株重组子HDY-ZMYWBG1、HDY-ZMYWBG2、HDY-ZMYWBG3。其中,HDY-ZMYWBG1及HDY-ZMYWBG3的混合碳源乙醇得率分别为0.368g/g、0.365g/g,均较宿主菌W5有所提高,分别提高了11.5%和9.7%。本课题研究的成功为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)木糖代谢途径的改造提供了新的成功实例,为以木质纤维素类生物质资源为原料进行生物乙醇的生产提供了可选择的菌种。