鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBV易发生变异,血清型众多,不同血清型毒株之间交叉保护性弱,研制与流行毒株血清型一致的疫苗并建立配套的免疫效果评价方法非常重要。近年来,QX型已成为当前亚洲和欧洲流行的优势血清型,在我国分离鉴定的流行毒株中占比超过70%。因此,本研究的目的就是研制一种针对QX型IBV亚单位疫苗,建立起与之相配套的检测QX型IBV抗体的间接ELISA方法,并与本实验室研制的鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗(La Sota株+QXL87株)配合,为QX型IBV的免疫防控提供全面的解决方案。1 QX型IBV抗体的间接ELISA方法建立通过Protean软件对QX型IBV CK/CH/JS/2010/12毒株(以下简称QXL株)的S1蛋白抗原性进行分析,选取该蛋白抗原性较强的5个部位,对应的基因片段分别命名为S1-A(61-525bp)、S1-B(454-933bp)、S1-C(835-1299bp)、S1-D(1453-1620bp)、S1-E(277-882bp)。S1蛋白氨基酸序列与IBV血清型分型密切相关,S1-A～S1-E5个多肽均位于S1蛋白高变区,利用Megalign软件将多肽氨基酸序列分别与6个疫苗毒株(H120、H52、MA5、M41、W93、4/91)的S1蛋白氨基酸序列进行比对,以S1-E多肽的变异率最高,与Mass型疫苗株及4/91疫苗株相比,变异率分别达到25%、20.3%,推测S1-E多肽是建立ELISA方法的最佳包被抗原。利用PCR方法扩增这5个基因片段,将5个基因片段分别克隆至pET-32a(+)载体进行原核表达,SDS-PAGE鉴定结果显示S1-A～S1-E这5个多肽均成功表达,大小与预期相符,分别为36.9kD、37.7kD、37.2kD、26.4kD、42.2kD。利用Ni-NTA亲和层析介质分别纯化出这5种多肽作为包被抗原,同时检测QX型IBV阳性血清与阴性血清,比较P/N值,结果显示S1-E多肽与阳性血清反应的灵敏度最高。以S1-E多肽作为ELISA包被抗原,经过一系列条件优化,包被抗原按1μ/mL稀释、HRP标记的兔抗鸡抗体按1:10000稀释为最佳工作浓度,除抗原需4℃孵育12 h,显色需37℃避光孵育10min,其余步骤按37℃孵育1 h为最佳工作条件。经测定,该方法与新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病毒等阳性血清无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于12%,表明该方法的重复性和特异性良好,可进一步用于QX型IBV疫苗抗体水平的监测。2 QX型IBV S1亚单位疫苗的研制利用PCR扩增QXL株的S1基因,截去信号肽部分,将该基因克隆到pET-32a(+)载体进行原核表达,SDS-PAGE鉴定结果显示蛋白表达形式主要为包涵体且大小与预期相符为70kD,将融合蛋白命名为S1。利用Ni-NTA亲和层析介质纯化变性条件下的S1蛋白,并经过蛋白透析液复性,以纯化复性后的S1蛋白为疫苗水相,白油为佐剂制成油包水剂型亚单位疫苗,每毫升疫苗含100 μg蛋白。3日龄SPF雏鸡随机分为四组:S1亚单位疫苗组、QXL87活疫苗组、QXL87+S1亚单位疫苗组和非免疫攻毒对照组,每组15只。于7日龄时以滴鼻点眼方式免疫QXL87活疫苗,免疫剂量为1羽份(103.5EID50),于21日龄以胸部肌肉注射方式免疫S1亚单位疫苗,免疫剂量为0.5 mL。亚单位疫苗免疫1周后,QXL87+S1亚单位疫苗组抗体水平显著上升且高于其他组。只免疫亚单位疫苗组的抗体水平在免疫21 d后明显上升。所有试验鸡于49日龄以滴鼻点眼的方式攻毒,所攻毒株为QXL毒株,攻毒剂量为104.0EID5C0/0.1mL。攻毒后观察10日,每日统计各试验组发病和死亡情况。结果显示S1亚单位疫苗组、QXL87活疫苗组和QXL87+S1亚单位疫苗组对QXL株的临床保护效力分别为70%、90%和90%。分别于攻毒后第2d、5 d、7d采取咽喉拭子及泄殖腔拭子,应用实时荧光定量PCR的方法测定各试验组排毒量,结果显示QXL87+S1亚单位疫苗组的排毒量最低,S1亚单位疫苗组的排毒量相较另外两个免疫组较高。攻毒后第10 d将所有试验鸡处死并剖检,分别取气管上中下三段制备成气管环,观察各试验组鸡气管的纤毛活力,结果显示免疫试验组鸡的气管纤毛活力基本在67%～100%之间,纤毛脱落少且活力较好,临床观察结果显示各免疫组试验鸡的气管和肾脏未见明显病变。综合临床保护效力、排毒量和气管纤毛活力这3个指标,单独免疫S1亚单位疫苗对QXL毒株的攻击可提供一定的保护;QXL87活疫苗和S1亚单位疫苗联合免疫时效果最佳,对QXL株的攻击能够达到足够的免疫保护效力。