随着人类基因组计划的基本完成,以功能基因组学和蛋白质组学为主要研究内容的后基因组时代来临。基因是遗传物质的载体,蛋白质才是生理功能的执行者。因此对基因组的研究有时并不能完全反映机体功能的变化,为了减少这种相对“误差”,迫切需要一种快捷,有效的蛋白质分析技术。蛋白质芯片技术应运而生。蛋白芯片(protein chip)是按预先设计的方式将抗原或抗体固定在玻片上,形成蛋白质的微阵列,即蛋白质芯片,带有特殊标记的蛋白质分子(抗体或抗原)与之特异性结合,通过对标记物的检测来实现抗原抗体的高通量互检。该技术所需蛋白质的量极少,检测反应相对较快,具有通量化,稳定性较好,灵敏度较高。目前在国内外这方面的研究都才刚刚起步。蛋白质芯片以蛋白质代替DNA作为检测目的物,比基因芯片更接近生命活动的物质层面,因而有着比基因芯片更加直接的应用前景。蛋白质芯片作为检测蛋白质存在和运动变化的高效工具,必将发挥越来越大的作用。 因本课题是国家科技攻关计划项目“人类肝脏蛋白抗体库的构建与应用”中的子项目,其主要研究任务是:利用获得的单克隆抗体研制适合肝脏蛋白表达谱和功能研究的抗体芯片,探索提高标记效率和芯片敏感性的方法,研制成肝脏蛋白抗体芯片和配套试剂,并应用于肝脏蛋白质的定性、定量和相互作用等研究。我们在经过文献检索之后,选择了一个基于环氧基表面修饰玻片的抗原-抗体结合反应体系,对在这一体系中抗原/抗体的固定方法、抗原-抗体特异性结合反应、蛋白质的标记方法及信号检测等问题进行研究,并尝试将这一体系应用于肝脏蛋白质组学的研究。得到以下实验结果: 1.预点样10个拷贝点后,各蛋白质样品的荧光测量值趋于稳定,可正式点样。 2.点样后的固定时间以24-48h为宜。时间过长或过短均会导致荧光测量值偏低。 3.使用乙醇胺封闭缓冲液的封闭效果最好。最佳的抗原-抗体特异性结合反应温度为37℃、时间为2h,选择1mg/ml作为最佳的点样浓度。 4.当点样浓度一定时,靶分子浓度增加,荧光信号强度也相应增加,且靶分子浓度在1ng/ml～1ug/ml范围内与荧光强度间有线性关系。