目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的神经系统变性疾病,其病理特征是黑质区多巴胺能神经元的大量缺失。这种严重威胁老年人的健康、影响其生活质量的疾病的发病率呈现逐年上升的趋势。PD是多因素疾病,其病因和发病机制仍不甚清晰,但是,积累的临床和实验证据表明,中枢神经系统的炎症在PD的发病和疾病进程中均起着关键作用。而小胶质细胞又在中枢炎症中扮演着重要角色,如释放各种炎症介质等,促进了神经系统变性疾病的发生和发展。虽然外周与中枢之间存在着血脑屏障(Blood brain barrier,BBB),但机体仍旧是一个不可分割的有机整体,因此,中枢神经系统的免疫状态将受到外周免疫状态的深刻影响。众所周知,外周炎症能够引起中枢的炎症,并与神经系统变性疾病的发病和进展密切相关。一个经典的例子是外周大剂量注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)后会造成脑内黑质区多巴胺能神经元的损伤。近来的几项流行病学研究证实,流感过后PD的发病率显著增加;另一方面,长期使用非甾体抗炎药会对外周免疫造成抑制,使PD的发病率降低了约50%。这些证据都强有力地说明了外周炎症对中枢的深刻影响。小胶质细胞是中枢神经系统胶质细胞中最重要的组成成分,作为中枢的固有免疫细胞,在调节脑内微环境中起着至关重要的作用。在静止状态下,小胶质细胞与神经元和平相处。一旦激活后,小胶质细胞可以通过改变其形态、增殖并上调表面抗原、分泌促炎因子和神经介质,如一氧化氮、前列腺素E2、活性氧等来启动炎症反应,并与其他神经胶质细胞、神经元等产生相互作用。现有的一些研究表明,由过度激活的小胶质细胞引发的中枢炎症可能会破坏脑内的微环境,继而威胁到神经元的存活,这其中也必然包括多巴胺能神经元。外周血单核巨噬细胞(Peripheral blood mononuclear,PBM)作为整个免疫系统的启动者和组织者,在机体的外周免疫活动中扮演着多重角色。我们团队最近进行的一项研究是在外周炎症之前耗竭单核细胞,这使得本应该发生的炎症得以削弱。这一研究说明单核细胞在外周炎症的形成和发展中起着至关重要的作用。随着时间的推移,越来越多的研究着眼于单核细胞在神经系统疾病中扮演的角色。一方面,脑内的小胶质细胞和外周血单核细胞同属单核巨噬细胞系统,具有相似的起源、功能及受体表达。正因为如此,很多学者认为单核细胞在外周的行为能够反应脑内小胶质细胞的免疫状态。另一方面,已有的证据表明单核细胞能够进入脑内演变为小胶质细胞,或者形成一群特殊的中枢神经系统巨噬细胞群。这些都表明单核细胞是外周免疫影响中枢免疫的重要媒介,其在外周的免疫状态对脑内炎症的转归意义非凡。炎症反应最初目的是保护机体,但凡事过犹不及。因此及时限制、下调免疫反应极为重要。实际上机体在进化过程中形成了一整套严格限制和下调免疫反应的机制,其中一个重要的环节即是免疫耐受的形成。免疫耐受是指免疫系统在受到首次刺激激活后,继续受到刺激将出现不应期,表现为促炎因子分泌下降,抗炎因子分泌上升,T细胞激活受到抑制等。免疫耐受是机体面对持续抗原威胁或连续打击的一种保护机制,它避免了不必要损伤的发生。单核细胞的内毒素耐受是由低剂量LPS诱导产生的,它被认为是免疫耐受的重要组成成分。Rosenzweig等人的实验发现外周低剂量LPS预处理对缺血脑组织起到了显著的保护作用,使梗塞面积下降了40%,此外低剂量LPS预处理的神经保护作用还被证实于脑创伤、低温循环阻滞脑损伤等神经损伤中。外周炎症会导致并加剧脑内炎症,随后,脑内炎症诱发的小胶质细胞异常激活会对多巴胺能神经元造成损伤,导致PD的发生。那么是否可以通过及时下调外周免疫反应来起到神经保护作用,现有研究对这方面涉猎的很少。考虑到低剂量LPS能够诱导单核巨噬细胞建立免疫耐受,而单核细胞是外周与中枢免疫连接的重要媒介,据此我们推测:低剂量LPS诱导了外周单核巨噬细胞免疫耐受,使其免疫活动下调,继而抑制小胶质细胞活化,下调脑内炎症,使更多的神经元免于无辜的炎症损伤,从而对神经元起到神经保护作用。研究方法:为了探讨低剂量LPS重复腹腔注射是否可以诱导大鼠外周血单核细胞免疫耐受的建立,我们给予大鼠0.3mg/kg LPS连续4天腹腔注射,在第5天时以淋巴细胞分离液及细胞贴壁法分离培养大鼠外周血PBM,并给予100ng/ml LPS再刺激。随后采用酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测培养PBM细胞上清中促炎因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的含量,采用蛋白质印迹(Western blotting,WB)检测培养PBM细胞表面抗原Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)的表达;同时,为了验证诱导大鼠外周血单核细胞免疫耐受形成的LPS剂量是否会在脑内黑质区产生炎症及造成多巴胺能神经元损伤,我们分别于外周处理后的第1d、7d、14d、28d,采用ELISA检测脑组织中促炎因子TNF-α、IL-1β的含量,采用WB检测脑组织中小胶质细胞标志抗原小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白抗体-1(Ionized calcium binding adapter molecule-1,Iba-1)的表达,采用免疫组化染色及细胞计数检测脑内黑质区多巴胺能神经元的存活状态。为了探讨纹状体内注射LPS是否可以模拟由神经炎症介导的PD模型,我们给予大鼠纹状体内立体定向注射15μg LPS,分别于颅内注射后的第1d、7d、14d、28d,采用免疫组化染色及细胞计数检测脑内黑质区多巴胺能神经元的存活状态,采用安非他明诱导的旋转实验评估大鼠的行为学损伤状况。为了探讨外周免疫耐受预处理是否会对后续的神经系统炎症起到缓解作用,并对多巴胺能神经元产生神经保护作用,我们预先给予大鼠0.3mg/kg LPS连续4天腹腔注射诱导其形成免疫耐受,随后给予大鼠纹状体内立体定向注射15μg LPS以模拟PD模型。分别于颅内注射后的第1d、7d、14d、28d,采用ELISA检测脑组织中促炎因子TNF-α、IL-1β的含量,抑炎因子白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)、转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)的含量,并采用实时定量反转录聚合酶链反应(Quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction,qRT-PCR)测定TNF-α、IL-1β的mRNA表达水平,以评价脑内黑质区炎症情况;采用免疫组化染色及免疫荧光染色测定小胶质细胞抗原Iba-1、ED-1的表达,并采用qRT-PCR测定ED-1的mRNA表达水平,以评价脑内黑质区小胶质细胞的激活情况;采用免疫组化染色及细胞计数检测脑内黑质区多巴胺能神经元的存活状态,采用安非他明诱导的旋转实验评估大鼠的行为学损伤状况。结果:1.低剂量LPS重复腹腔注射可以诱导大鼠外周血单核细胞免疫耐受的建立。2.诱导大鼠外周血单核细胞免疫耐受形成的LPS剂量不会引起脑黑质内的炎症。3.诱导大鼠外周血单核细胞免疫耐受形成的LPS剂量不会引起脑黑质内的多巴胺能神经元损伤。4.LPS纹状体内注射可以诱导脑内黑质区多巴胺能神经元损伤。5.LPS纹状体内注射可以导致大鼠行为学发生变化。6.外周免疫耐受预处理抑制纹状体内注射LPS介导的脑内黑质区促炎因子的分泌。7.外周免疫耐受预处理不影响纹状体内注射LPS介导的脑内黑质区抑炎因子的分泌。8.外周免疫耐受预处理抑制纹状体内注射LPS介导的脑内黑质区小胶质细胞的激活。9.外周免疫耐受预处理削弱纹状体内注射LPS介导的脑内黑质区多巴胺能神经元损伤。10.外周免疫耐受预处理改善纹状体内注射LPS介导的大鼠行为学损害。结论:我们的研究结果表明,连续低剂量LPS腹腔注射可以诱导外周血单核细胞免疫耐受的建立。纹状体内LPS立体定向注射可以很好地模拟中枢炎症诱导PD发生的大鼠模型建立。外周免疫耐受是调节PBM免疫活性的重要机制。我们的研究结果亦强烈地表明外周免疫耐受预处理能够缓解后续的神经系统炎症,并在神经系统炎症介导的神经毒性中产生神经保护作用。这将为神经系统变性疾病提供新的治疗方法。