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番木瓜环斑病毒(Papaya Ringspot Virus, PRSV)属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒,是制约番木瓜种植业和加工产业的主要因素。在马铃薯Y病毒基因组5’端,存在病毒基因组连接蛋白(virus genome-linked protein, VPg), VPg可在病毒的感染周期中干预几个步骤,包括病毒RNA的复制,病毒细胞间移动和长距离移动。真核翻译起始因子4E (eukaryotic translation initiation factor 4E, eIF4E)能够与mRNA的帽子结构或帽子同系物特异地交叉结合,在蛋白质合成的起始中起关键作用。通常情况下,mRNA是通过5’帽子结构与eIF4E结合,但马铃薯Y病毒属病毒基因组的5’端没有帽子结构,而是共价结合VPg蛋白。研究发现,病毒基因组连接蛋白VPg与eIF4E的结合在多种马铃薯Y病毒属病毒侵染植物过程中起关键作用,通过突变eIF4E的关键位点能影响病毒-植物的互作,并能介导植物对病毒的抗性。eIF4E是一个多基因家族,在植物中eIF4E家族成员包括eIF4E及其异构体eIFiso4E,这两个因子在翻译起始过程的作用相同,但在结合m7GpppN和其他帽类似物的能力上存在差异。同一宿主植物中,马铃薯Y病毒利用eIF4E及其异构体的能力存在差异,而番木瓜eIF4E和eIFiso4E与PRSV-VPg结合情况尚未报道。因此本研究通过克隆番木瓜Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E基因,利用GAL4酵母双杂交系统和双分子荧光互补技术探究PRSV-VPg与Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E的互作情况,为以eIF4E为靶点进行抗PRSV研究奠定基础。以番木瓜嫩叶为材料提取RNA,通过RT-PCR、5’-Full RACE和3’-Full RACE获得了Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E基因编码区全长,Cp-eIF4E全长1185bp,其中开放阅读框为708 bp,编码236个氨基酸；Cp-eIFiso4E全长995bp,其中开放阅读框为618 bp,编码206个氨基酸。以本实验室保存PRSV海南分离物为模板,通过PCR扩增获得PRSV-VPg基因,开放阅读框为561 bp,编码187个氨基酸。利用细胞核内酵母双杂交—GAL4系统研究PRSV-VPg与Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E的互作情况,分别构建含PRSV-VPg基因的诱饵载体和含Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E基因的激活域载体,并对其进行自激活和毒性检测。用醋酸锂转化法将其转入酵母菌株YRG-2中,通过营养缺陷筛选及β-半乳糖苷酶筛选。结果表明：PRSV-VPg与Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E均存在不同程度的互作。为进一步研究PRSV-VPg与Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E的互作情况,采用双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescence complementation, BiFc)对其进行互作研究。分别构建PRSV-VPg基因的BiFc-pSATN-nEYFP载体和含Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E基因的BiFc-pSATN-cEYFP载体。通过基因枪轰击洋葱表皮细胞,培养12-16h。荧光显微镜下观察发现PRSV-VPg与Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E均在植物细胞中发生互作,互作结果与GAL4系统研究结果一致。对这种互作作用的推测,最有可能的是PRSV-VPg与Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E结合可推动病毒蛋白的翻译起始和积累。本研究结果对揭示PRSV致病机理奠定了理论基础,同时亦为以eIF4E为靶点进行番木瓜抗PRSV研究提供了实践基础。