急性肺损伤（Acute lung injury ALI）/急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome ARDS）是儿童重症中死亡率非常高的危重症之一,它是由各种原因引起的严重肺部损伤性疾病。病理特征是肺泡上皮和内皮细胞损伤,肺泡-毛细血管膜通透性增加,导致非心脏源性急性肺水肿。临床表现为严重缺氧,呼吸窘迫,气体交换障碍,呼吸力学损伤。虽然对ARDS的发病机制有很好的了解,但对其在基因水平上的调控机制知之甚少,由于ARDS的分子机制仍未完全明了,缺少特异性治疗手段,死亡率仍然高达30-40%,是危重患儿死亡的重要原因。虽然近期医学取得了很大的进步,但是ARDS的诊断和治疗仍然是一个挑战。微小核糖核酸（microRNA,miRNA,miR）是一类广泛存在于真核生物中的、长约21～25碱基的非编码小分子RNA。在动物体中,它的作用机制为是以不完全互补的方式和靶基因的3’端非编码区序列相结合,通过抑制蛋白质的翻译发挥它的生物学功能,这种调控一般不会影响靶基因mRNA的稳定性。miRNA通过这种作用机制抑制靶基因的表达,进而在关键蛋白质的合成、神经细胞的发育、肿瘤的发生、细胞的凋亡和炎症相关的疾病等方面发挥重要作用。miRNA具有广泛的基因调节功能,多种miRNA在同一个细胞中的表达使得细胞处在一种内在的miRNA环境中,这个环境控制着成千上万编码基因的miRNA,使各种蛋白的表达处在一个合适的水平,调控各种关键蛋白质的表达。miRNA机制的研究可能是基因、蛋白水平有关ARDS发病机制及治疗研究的重要补充。在ALI/ARDS领域中,识别与该综合征相关的miRNAs,不仅有助于我们理解其所涉及的病理生理机制,而且有助于确定潜在的治疗靶点。miRNA可能是ARDS合适的生物学标志物,目前已经发现了大量的miRNA和ARDS的诊断、预后等相关。随着miRNA与ARDS之间的关系通过全基因组miRNA谱分析的研究进展,更多与免疫反应、炎症通路、疾病发展和疾病严重程度相关的miRNA可以作为一种诊断和监测ARDS新的评估工具。我们前期的研究发现在ARDS的小鼠模型的肺组织中microRNA-424（miR-424）显著下调,进行靶基因预测及深度分析发现其与炎症、细胞凋亡、肺表面活性蛋白、肺发育、肺纤维化等相关。其他研究也发现miR-424的表达在ARDS患儿的肺泡灌洗液中发生了显著变化。miR-424也影响炎症反应,研究发现miR-424升高可通过CDK6依赖途径抑制淋巴细胞和中性粒细胞的炎症反应,从而影响急性卒中。然而,miR-424的表达是否与人类ARDS的发病相关?miR-424具体的作用机制是什么?miR-424能否作为ARDS患儿早期诊断和预后判断的生物学标志?这些仍不清楚。为了研究上述问题本课题包含以下三个部分:第一部分:探讨ARDS患儿外周血单个核细胞中miRNA谱的差异表达及其可能的意义。第二部分:在细胞水平验证miR-424具体的调节机制。第三部分:临床探讨miR-424能否作为ARDS患儿早期诊断和预后判断的生物学标志。第一部分ARDS患儿外周血中miRNAs表达谱分析目的:采用高通量miRNA测序技术筛查ARDS患儿外周血miRNA的表达谱,筛选出差异表达的miRNA及可能的生物学功能,为ARDS的发病机制研究提供线索。方法:1.选取2019年5月在河南省人民医院PICU住院5例ARDS患儿,5例脓毒症患儿,选取同期5名来医院体检的同龄健康儿童作为对照组。2.分别留取各组患儿清晨空腹外周静脉血,分离出单个核细胞,抽提与纯化总RNA,进行miRNA高通量测序,筛选出差异表达的miRNA。3.对差异表达的miRNA进行靶基因预测,应用在线数据库对候选靶基因进行GO分类功能注释分析和KEGG通路富集分析。结果:1.与对照组相比,ARDS组共有33个差异表达miRNAs,其中7个miRNAs表达上调,26个miRNAs表达下调。2.与脓毒症组相比,ARDS组共有37个差异表达miRNAs,其中4个miRNAs表达上调,33个miRNAs表达下调。3.miR-424在ARDS组和脓毒症组较对照组表达均下调,且和脓毒症组相比,miR-424在ARDS组表达也是下调。通过在线数据库预测和筛选目标miRNAs的靶基因,并统计候选靶基因数目,发现miR-424预测的靶基因数目有132个,证实的靶基因数目有93个。4.GO分类功能注释分析和KEGG通路富集分析显示:差异表达miRNAs预测的靶基因主要参与于miRNA调控基因沉默、mRNA分解代谢过程、炎症相关、肺发育相关、细胞凋亡相关等。富集于细胞循环、细胞凋亡通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路等。结论:1.在儿童ARDS外周血单个核细胞中,存在大量显著差异表达的miRNAs。2.生物信息学分析显示,显著差异表达的miRNAs可能通过多种生物过程影响ARDS的发生发展,包括免疫相关通路、炎症相关通路等。3.miR-424可能参与了儿童ARDS的发生、发展。第二部分m i R-424过表达靶向FGF2通过NF-κ B通路保护肺泡上皮细胞的细胞凋亡和炎症反应目的:通过ARDS细胞模型,探讨miR-424在肺泡上皮细胞中的具体作用机制。方法:1.使用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和阴性对照诱导A549和BEAS-2B细胞24小时,酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定各组细胞上清中白细胞介素6（Interleukin 6,IL-6）和白细胞介素 8（Interleukin 8,IL-8）的表达量;定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）测定各组细胞中的miR-424相对表达量。2.A549 和 BEAS-2B 细胞分别转染 miR-424 mimic、miR-424 inhibitor 及其阴性对照,LPS诱导后利用RT-PCR来测定各组细胞中的miR-424相对表达量。3.A549 和 BEAS-2B 细胞分别转染 miR-424 mimic、miR-424 inhibitor 及其阴性对照,LPS诱导前后TUNEL方法检测各组细胞的凋亡情况;Western Blot法检测各组细胞中裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）的表达情况;ELISA法测定各组细胞上清中IL-6和IL-8的表达量;Western Blot法检测各组细胞中FGF2蛋白的表达情况。4.使用TargetScan和miRDB靶基因预测软件,预测miR-424的可能靶基因,并采用双荧光素酶报告基因方法验证miR-424和FGF2之间的靶向关系。5.A549和BEAS-2B细胞分别转染腺病毒pAd-FGF2、FGF2 siRNA及其阴性对照,LPS诱导后Western Blot法检测各组细胞中FGF2蛋白的表达情况。6.A549 和 BEAS-2B 细胞分别转染 FGF2 siRNA、miR-424 inhibitor、FGF2 siRNA+miR-424 inhibitor、腺病毒 pAd-FGF2、miR-424 mimic、腺病毒pAd-FGF2+miR-424 mimic及其阴性对照,LPS诱导后TUNEL方法检测各组细胞的凋亡情况;ELISA法测定各组细胞上清中IL-6和IL-8的表达量。7.A549和BEAS-2B细胞分别转染腺病毒pAd-FGF2、阴性对照及其空白对照,LPS诱导前后Western Blot法检测各组细胞核蛋白p-p65表达量及免疫细胞化学染色观察p65的易位情况。8.A549和BEAS-2B细胞分别转染miR-424 inhibitor及其阴性对照,BAY11-7082处理前后,LPS诱导后TUNEL方法检测各组细胞的凋亡情况及ELISA测定各组细胞上清中IL-6和IL-8的表达量。结果:1.和对照组相比,LPS诱导肺泡上皮细胞后IL-6和IL-8的水平显著增加,miR-424的表达显著下调。2.与对照组相比,转染miR-424 mimic后A549和BEAS-2B细胞中miR-424表达量显著增加,转染miR-424 inhibitor后A549和BEAS-2B细胞中miR-424表达量显著下降。3.LPS诱导细胞后细胞的凋亡显著增加,miR-424 mimic显著减轻LPS诱导的A549和BEAS-2B细胞的细胞凋亡,miR-424 inhibitor显著加重LPS诱导的A549和BEAS-2B细胞的细胞凋亡。4.与对照组相比,裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在miR-424 inhibitor组显著增加,在miR-424 mimic组显著降低。5.与对照组相比,miR-424 mimic减轻了 LPS诱导的细胞上清中IL-6和IL-8的分泌量,miR-424 inhibitor增加了 LPS诱导的细胞上清中IL-6和IL-8的分泌量。6.TargetScan和miRDB靶基因预测软件分析FGF2可能是miR-424的一个靶基因,双荧光素酶报告基因检测结果也证实了 FGF2是miR-424靶基因。7.与对照组相比,miR-424 mimic显著抑制了 LPS诱导的细胞中FGF2蛋白的表达水平,miR-424 inhibitor显著增加了 LPS诱导的细胞中FGF2蛋白的表达水平。8.和对照组相比,转染腺病毒pAd-FGF2细胞组FGF2蛋白表达量明显增加,转染FGF2 siRNA细胞组FGF2蛋白表达量明显下降。9.和对照组相比,沉默FGF2可降低LPS诱导的A549和BEAS-2B细胞的细胞凋亡,miR-424 inhibitor可增加LPS诱导的A549和BEAS-2B细胞的细胞凋亡,然而,miR-424 inhibitor不能调节体内只有极低FGF2含量细胞的细胞凋亡。但是,过表达的FGF2逆转了由miR-424 mimic抑制的细胞凋亡。10.和对照组相比,FGF2过表达可增加LPS诱导的A549和BEAS-2B细胞的IL-6和IL-8的分泌量,miR-424 mimic可降低LPS诱导的A549和BEAS-2B细胞的IL-6和IL-8的分泌量,过表达FGF2逆转了由miR-424 mimic抑制的LPS诱导后A549和BEAS-2B细胞中IL-6和IL-8的分泌量。无论是否使用miR-424 inhibitor,沉默FGF2都会降低LPS诱导的A549和BEAS-2B细胞中IL-6和IL-8的分泌量。11.和对照组相比,LPS诱导可提高A549和BEAS-2B细胞核蛋白p-p65表达水平,过表达FGF2增加了 LPS诱导的A549和BEAS-2B细胞核蛋白p-p65表达水平。在LPS诱导前p65主要在细胞质中表达,LPS诱导24 h后p65逐渐进入细胞核。转染腺病毒pAd-FGF2后进一步促进了 p65在细胞核中的表达。12.和对照组相比,BAY11-7082处理细胞后减弱了由miR-424 inhibitor所致的细胞凋亡和细胞上清中IL-6和IL-8的分泌量。结论:1.miR-424通过靶向FGF2调节LPS诱导的肺泡上皮细胞的凋亡和炎症反应。2.miR-424通过NF-κB途径调节肺泡上皮细胞的凋亡和炎症反应。第三部分miR-424评估ARDS患儿早期诊断及预后的预测价值目的:探讨miR-424对脓毒症合并ARDS风险的预测价值以及与ARDS患儿预后的相关性。方法:1.采用前瞻性研究,收集我院2020年2月至2021年2月收治的脓毒症患儿（含ARDS）的一般资料,根据是否合并ARDS,分为脓毒症合并ARDS组,脓毒症不合并ARDS组,同时选择选取20名同龄健康儿童作为对照组。所有脓毒症患儿均有ARDS发生记录和ARDS死亡记录,并采集他们的血液样本,通过RT-qPCR检测外周血单个核细胞中miR-424的表达量。2.通过Pearson相关分析探讨脓毒症合并ARDS患儿的miR-424表达量与儿童危重症评分（Pediatric Critical Illness Score,PCIS）、顺序器官功能衰竭（Sequential organ failure assessment SOFA）评分、P/F 值（PaO2/FiO2）、C 反应蛋白（C-reactiveprotein,CRP）、降钙素原（procalcitonin,PCT）、IL-6 和 IL-8 等之间的关系。3.采用受试者工作特征曲线下面积（AU-ROC）评估miR-424对脓毒症合并ARDS风险的预测价值。4.脓毒症合并ARDS患儿分为存活组和死亡组,检测miR-424、IL-6和IL-8等在存活组和死亡组的表达情况,并通过多因素logistic回归分析影响ARDS患儿预后的因素。采用受试者工作特征曲线下面积（AU-ROC）评估miR-424对脓毒症合并ARDS组患儿死亡的风险。结果:1.本研究共纳入121例脓毒症患者,其中脓毒症合并ARDS组36例。miR-424在脓毒症合并ARDS组患儿血液中的表达量明显低于脓毒症不合并ARDS 组。2.脓毒症合并ARDS组患儿血液的miR-424表达量与IL-6、IL-8水平及CRP呈负相关;与PCIS评分、P/F值、白蛋白呈正相关。3.受试者工作特征（ROC）曲线显示:miR-424的表达量（AUC:0.908,95%CI:0.856-0.960）能够对脓毒症患儿是否发生ARDS有早期预测价值。4.与ARDS存活组相比,死亡组中miR-424明显下降;多因素logistic回归分析显示miR-424表达量、白蛋白是ARDS患儿死亡的独立危险因素。5.miR-424（AUC:0.845,95%Cl:0.696-0.995）的降低预示着 ARDS 患儿死亡风险的增加。结论:1.miR-424对ARDS患儿的早期诊断有预测价值。2.miR-424对ARDS患儿预后的判定有预测价值。